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新品展示 | 一种用于NanoLuc®报告基因系统的脑渗透性生物发光底物: Cephalofurimazine (CFz)
一种用于NanoLuc®报告基因系统的脑渗透性生物发光底物
我们在此报告发现了一种新型脑渗透性NanoLuc®萤光素酶底物，将其命名为Cephalofurimazine (CFz)。该底物是furimazine(Fz)的氟化类似物，是通过大量构效关系研究发现的，旨在寻找能够高效渗透中枢神经系统并在脑中良好分布的NanoLuc®底物。
我们展示了该底物在表达NanoLuc®与橙色荧光蛋白CyOFP融合蛋白的转基因小鼠脑内的信号。该融合蛋白分别与两种已知在全脑范围内表达的蛋白——CamkIIa 和 Vglut2 相连接，并被证实所获信号与这些蛋白在小鼠脑中的已知表达谱一致。进一步证明，CFz/NLuc-CyOFP系统结合头戴式摄像头足以对自由活动小鼠的脑活动进行成像。最后，借助NanoLuc®生物传感器易于构建的特性，我们将CFz与基于NanoLuc®的钙离子传感器相结合，展示了小鼠脑内响应后肢刺激而产生的钙依赖性生物发光信号。
Antares体内成像
Antares是一种NLuc与CyOFP的融合蛋白，可在NLuc底物作用下发出明亮的橙色生物发光；
FFz是经过优化的Fz类似物底物，适用于外周体内生物发光成像——此处展示其与AkaLuc/AkaLumine在免疫肿瘤学中的多重检测应用1
不同底物在大脑内的信号分布
Fz的分布特征与文献报道一致，证实Vgat表达于大脑前部区域；
尽管FFz及其他苯胺类底物具有更优的溶解性及外周生物发光成像性能，却意外在大脑其他区域出现信号；
CFz通过底物筛选脱颖而出，成为一种兼具高亮度、可配制的、且具备适宜大脑分布特征的底物。
CFz在体内实验中表现出理想的中枢神经系统药代动力学和药效学特性。
CFz的制剂特性
CFz显示出对所用辅料用量的一定程度剂量依赖性。
该制剂可冻干为块状物，便于在所选缓冲液中复溶并立即进行腹腔注射。
所用辅料对小鼠无毒，且注射剂不含有机溶剂。
Vgat-Antares与Vgat-FLuc转基因小鼠的对比（二者在CamkIIa的对比结果与之相似）；
CFz/NLuc系统与甲虫萤光素酶系统互不干扰，其亮度优于传统脑部生物发光成像系统；
CFz/NLuc与AkaLuc/AkaLumine系统的亮度相当，正如FFz外周成像结果中展示的那样，CFz/NLuc与AkaLuc/AkaLumine这两个系统非常适合进行多重检测（multiplexing）。
CFz实现在自由移动的小鼠中进行BLI
CFz/Antares体系的高亮度实现了对清醒小鼠生物发光的视频级成像。
NanoLuc®适用于生物传感器的构建；
CaMBI是一种基于Antares的强度计量式钙离子传感器，适用于体内钙离子通量成像2；
结合头戴式摄像装置，CFz实现了对刺激响应的实时动态监测。
总结
CFz已完成合成、制剂化及针对小鼠中枢神经系统生物发光成像（腹腔注射给药）的特性表征；
CFz/Antares体系在中枢神经系统成像方面优于所有已报道的海洋萤光素酶系统；
CFz/CaMBI结合头戴式摄像装置，实现了对清醒小鼠钙离子通量的实时动态成像。
参考文献：
Su, Y., et al. (2020). "Novel NanoLuc substrates enable bright two-population bioluminescence imaging in animals." Nature Methods 17: 852-860.
Oh, Y., et al. (2019). "An orange calcium-modulated bioluminescent indicator for non-invasive activity imaging." Nature Chemical Biology 15(5): 433-436.
