1. 基本信息

如下图所示，为构建 CA16-Nluc感染克隆，将 Nluc基因插入在 5’UTR和 P1区域之间。通过反向遗传学拯救出rCA16-Nluc病毒，并对rCA16-Nluc进行了体外鉴定。

接下来，我们验证了 rCA16-Nluc 的遗传稳定性(如下图所示)，以及报告病毒在抗体和抗病毒药物方面筛选中的应用。

1. 病毒拯救：本研究主要通过反向遗传学技术拯救报告病毒。具体地，测序正确的感染性克隆经 T7 体外转录后，将纯化的 mRNA 转染细胞，从而拯救出活毒。

2. 荧光素酶实验：本研究主要涉及的荧光素酶实验包括抗病毒活性测试和中和抗体测定(RLU-Nab)。

2.1 抗病毒活性测试：用含 2% FBS 的 DMEM 培养基将药物稀释后，50 μL/well 含有不同浓度梯度的药物与 50 μL/well 报告病毒在 37°C共孵育 2 h(根据不同药物的作用机制不同可以调整药物和病毒的添加顺序)，同时设置无病毒和药物的细胞组以及只加病毒的组，每组 3个复孔；弃细胞培养上清，PBS 轻轻洗涤 2 遍，随后加入孵育后的 100 μL 溶液与细胞共培养 24 h；配制 Nluc 荧光素酶检测试剂，将 10 mL Nano-Glo^® Luciferase Assay Buffer 加入 200μL Nano-Glo^® Luciferase Assay Substrate 中，混匀后平衡至室温，随后加入 100μL/well 荧光素酶试剂并室温孵育 5min，最后使用 Promega 发光仪检测荧光素酶活性。

2.2 RLU-Nab：动物血清经 56°C灭活后，用含 2% FBS 的 DMEM 培养基将血清 2 倍梯度稀释；50 μL 病毒与等体积不同稀释度的血清混合，37°C，孵育 2 h，同时设置阴性对照组血清、只含病毒不含血清组、只含血清不含病毒组，每组设置 3 个重复；弃细胞培养上清，PBS轻轻洗涤 2 遍，随后加入孵育后的 100 μL 溶液与细胞共培养 24 h；Nluc 荧光素酶检测试剂室温溶解后，随后加入 100μL/well 荧光素酶试剂并室温孵育 5min，最后使用 Promega 发光仪检测荧光素酶活性。荧光素酶活性 2.5 倍高于空白对照孔时，认定为阳性孔。

与 rCA16 相比，rCA16-Nluc 表达相似水平的病毒 2C 蛋白。

基于 rCA16-Nluc，我们测试了其在抗病毒活性测试和中和抗体滴度中的应用。以 GuHCl,ribavirin, chloroquine, 和 NH4Cl 四种药物为例，通过测试 Nluc 荧光素酶活性快速的测定了四种药物抗 CA16 病毒的 IC₅₀。

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