HiBiT：用于评估基于MOA的CAR-T细胞效价的微小标签
1. NanoBiT®技术可实现新型靶细胞杀伤检测
● 效应细胞和表达HiBiT的靶细胞共孵育可导致靶细胞的肿瘤相关抗原（TAA）依赖性裂解和HiBiT释放至培养基中；
● HiBiT可与HiBiT检测试剂中的非细胞渗透性LgBiT进行结合，从而形成功能性NanoBiT®萤光素酶并发光；
● 能够实现对双特异性T细胞衔接系统（BiTE）和细胞治疗产品进行基于MOA的快速效价检测。
2. CAR-T检测的检测设计和工作流程
检测流程
1. 铺板表达TAA的HiBiT靶细胞；
2. 加入CAR-T细胞；
3. 加入HiBiT检测试剂；
4. 读板。
特点
● 低水平自发释放（<10%最大释放）
● 信号仅来自靶细胞
● 简单、快速和灵敏
优势及应用：
Promega开发了生物发光靶细胞杀伤生物测定平台，用于探索和开发T细胞重定向癌症疗法。
基于HiBiT的CAR-T和TDCC检测
● 使用HiBiT互补技术，可测定混合培养物中的靶细胞特异性杀伤情况；
● 反映CAR-T、TCR-T和BiTE疗法的作用机制（MOA）；
● 适用于延时孵育时间和批间比较；
● 可使用多种生理学相关靶细胞进行检测；
● 添加、混合、读取这一简单操作模式均相、灵敏和快速。
01
NanoBiT® TCK检测的抗原特异性
A.）将使用CAR-19或GFP对照慢病毒转导的T细胞与具有不同E：T比值的Ramos/HiBiT靶细胞进行混合。过夜孵育后，加入NanoBiT®细胞外检测试剂，并使用GloMax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。使用洋地黄皂苷透化靶细胞测定最大释放量。
B.) 将CAR-19 T细胞与Ramos/HiBiT靶细胞或Ramos/HiBiT CD19敲除靶细胞进行混合。
02
延长检测孵育时间可显示系列TCK效应
将使用CAR-19或GFP对照慢病毒转导的T细胞与具有不同E：T比值的Ramos/HiBiT靶细胞进行混合。孵育规定时间后，加入NanoBiT®细胞外检测试剂，并使用Glomax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。EC50随时间发生左移，表明在较低E：T比值下可连续实现靶细胞杀伤。
03
NanoBiT® TCK检测法可反映批间效价差异
使用CAR-19慢病毒转导T细胞，然后分别使用IL-7、IL-15或同时使用两种细胞因子，在5ng/mL浓度下对其进行扩增。8天后，对各批次中CAR19+细胞的密度进行标准化处理，并将细胞按照规定比例与Ramos/HiBiT靶细胞合并后处理24小时。然后加入NanoBiT®细胞外检测试剂，并使用GloMax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。
04
靶细胞背景和应用
|
靶细胞 |
代表性靶抗原 |
|
Raji |
CD19、CD20 |
|
Ramos |
CD19、CD20 |
|
H929 |
BCMA |
|
A549 |
EGFR |
|
SK-BR-3 |
HER2 |
|
SKOV3 |
HER2、EGFR |
|
OVCAR-3 |
HER2、EGFR |
|
CHO |
外源性靶标表达，包括mTNFa、CD19、病毒抗原 |
|
K562 |
|
验证过的NanoBiT®靶细胞杀伤应用 |
|
ADCC（PBMC） |
|
CAR-T（CD4+/CD8+T细胞） |
|
TDCC（活化CD8+T细胞） |
|
ADCP（巨噬细胞） |
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05
多个肿瘤细胞系的TDCC检测
检测流程
1. 铺板HiBiT靶细胞；
2. 加入TDCC预确认CD8 T细胞；
3. 加入CD3xTAA双特异性分子；
4. 孵育；
5. 加入HiBiT检测试剂；
6. 读板。
06
NanoBiT® TDCC可测定悬浮和贴壁靶细胞系中的BiTE效价
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