研究者通过实验证明在肝星状细胞中ALKBH5和NF-κB p65之间存在正反馈调控通路，并使用双荧光素酶报告基因实验证实了NF-κB p65可以调控ALKBH5基因的表达。

文章题目：ALKBH5-mediated m6A demethylation of TIRAP mRNA promotes radiation-induced liver fibrosis and decreases radiosensitivity of hepatocellular carcinoma

发表期刊：Clinical and Translational Medicine

发表日期：2023

关键词： Hepatic stellate cells, Monocytes, N6-methyladenylate methylation, Radiation-induced liver injury, Radiotherapy

作者及单位：南方医院放疗科周佩涛/陈宇翰/吴德华课题组。

● ALKBH5介导的TIRAP mRNA的m6A甲基化促进放疗后肝星状细胞的活化；

● ALKBH5通过调控CCL5-CCR5轴促进单核细胞的募集并向M2型巨噬细胞极化；

● 放疗后的肝星状细胞通过“教育”单核细胞促进肝星状细胞活化并通过分泌CCL20降低肝癌细胞的放疗敏感性；

● 阻断ALKBH5-CCR6轴可以减轻放射性肝纤维化并提升肝癌细胞的放疗敏感性。

文章模式图

1. 通过JASPAR网站预测NF-κB p65与ALKBH5启动子的结合位点；

2. 通过ChIP实验验证NF-κB p65与ALKBH5启动子的结合位点；

3. 利用GV354载体构建ALKBH5-WT和ALKBH5-Mut过表达质粒，并转入HEK 293T细胞；

4. 通过双荧光素酶报告基因实验验证NF-κB p65是否与ALKBH5启动子存在结合。

如下图所示，研究者利用GV354载体构建ALKBH5-WT和ALKBH5-Mut过表达质粒，质粒上同时拥有萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的表达基因。

文中主要通过双荧光素酶报告基因实验验证NF-κB p65与ALKBH5启动子存在结合。该方法的实验步骤如下图所示：

图2.  双荧光素酶报告基因实验示意图

在肝星状细胞LX2中过表达ALKBH5，发现磷酸化的NF-κB p65表达上调，而敲低ALKBH5则得到相反的趋势，说明ALKBH5可以促进NF-κB p65的磷酸化，激活NF-κB信号通路。

1. 双荧光素酶报告基因受多种因素影响（细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），建议实验一般需要做3个或3个以上复孔；

2. 细胞培养时间不宜过长，建议12-36h。长时间培养后，细胞较难裂解；

3. 萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物加入量可根据实际情况调整，但需要保证底物过量，不然容易造成检测结果偏差大；

4.  检测前应检测孔板或空管的发光值，作为发光背景值，一般小于100；样品发光值应该远大于背景值。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

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