甘油三酯的检测方法
检测甘油三酯及其代谢对了解代谢性疾病的机制具有重要意义。传统检测脂质代谢的方法,如染色法、比色法或荧光法以及质谱法都已经得到应用,但每种方法都有其局限性。
哺乳动物利用脂质(主要是甘油三酯)来长期储存能量。在用餐后,人体合成甘油三酯来储存多余的能量,在空腹期间甘油三酯分解来为身体的所有细胞提供能量。甘油三酯的合成(脂肪生成)和分解(脂肪分解)是由激素介导的信号级联紧密调节的。
图.脂肪生成和脂肪分解作用。甘油三酯分子由三个高能脂肪酸与一分子甘油酯化形成。甘油三酯的合成称为脂肪生成,而甘油三酯的分解称为脂肪分解。
许多疾病状态下可以观察到甘油三酯代谢失调,包括糖尿病、肥胖、肝病(如肝脏脂肪变性、NAFLD、NASH)和癌症。为了更好地理解和开发以上提到的疾病和其他疾病的治疗方法,研究人员需要检测工具来监测生物样本中的甘油三酯代谢。脂肪生成是通过检测甘油三酯水平的变化来测量的,而脂肪分解通常是通过检测甘油水平的变化来测量的。
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检测甘油三酯代谢的传统方法
1. 染色
各种便宜的染色剂可用于评估组织或细胞培养样本中的脂质水平(例如 Oil Red O, BODIPY®染料)。染色结果可在显微镜下观察,并可推断脂肪分解或脂肪生成的进展。染色的方法无法区分甘油三酯和其他中性脂类。
2. 基于微孔板的比色法和荧光检测法
这些基于微孔板的检测试剂盒使用混合酶将甘油三酯或甘油转化为可检测的比色或荧光信号。这些检测方法可用于定量代谢并与各种类型样本兼容。
3. 质谱分析
光谱测定方法可以提供一个完整的“脂质组”的图片——在一个生物样品中存在的所有脂质种类。这些实验产生了大量的定量数据集合,可以用来描述脂质代谢过程。
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生物发光测定监测甘油三酯代谢
Promega提供了一种更简单的方法来研究和监测甘油三酯代谢:甘油三酯检测Triglyceride-Glo™ Assay和甘油检测Glycerol-Glo™ Assay。这些“添加-读取”形式的分析方法适用于多种样本类型,包括裂解的细胞、培养基、组织匀浆、血清和脂蛋白组分。基于发光法比基于比色法或荧光法的分析更灵敏,并提供可靠、准确的和定量的代谢变化。
实验原理及步骤
这两种方法的核心是甘油分子数量和产生光信号的相关性。仅针对Triglyceride-Glo™ Assay,需要初始脂肪酶处理将甘油三酯转化为甘油。然后,在两个实验中,一对酶(甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶)氧化甘油生成NADH。接下来,一种还原酶利用NADH还原酶将萤光素底物前体转化为萤光素。最后,Ultra-Glo™rLuciferase氧化萤光素产生可见光。产生的光信号可以通过发光检测仪测量,并与开始样品中甘油三酯/甘油的数量呈现相关性。Ultra-Glo™rLuciferase酶无论在去污剂、还原剂或温度波动的情况下都可以持续的发出明亮的光,所以该分析方法输出是稳健的,并且适用于多种样品类型。
Triglyceride-Glo™ Assay和 Glycerol-Glo™ Assay有一个简单的操作方案:只需向样品中添加试剂,孵育,并使用任何具有读板功能的发光检测仪。制备样品不需要有机萃取、极端温度或高速离心。相反,检测使用一个简单的30分钟去污剂裂解步骤。细胞培养实验中,检测试剂可直接加入含有细胞的孔中,也可把细胞培养基取出加入单独的平板进行培养基检测。后一种方法使培养的细胞可用于另外的下游实验检测,如检测其他代谢物或细胞活力。此外,Triglyceride-Glo™ Assay和 Glycerol-Glo™ Assay可用于384孔板的高通量筛选应用。
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在糖尿病研究中监测胰岛素活性
胰岛素是脂质代谢的关键调节剂。在肝细胞和脂肪细胞中,它促进脂肪生成并抑制脂肪分解。使用 Triglyceride-Glo™ 和 Glycerol-Glo™ Assays,您可以监测胰岛素和其他效应物对脂质代谢的影响。在下图中,Glycerol-Glo™ Assay 用于监测脂肪细胞中的脂肪分解。用异丙肾上腺素处理会增加基础水平以上的脂肪分解。用异丙肾上腺素和胰岛素处理也导致脂肪分解的增加,但增加少于单独使用异丙肾上腺素。通过这种方式,Glycerol-Glo™ Assay 可用于评估脂肪分解的激活剂和抑制剂。
图. 胰岛素介导的脂肪细胞甘油释放抑制。从 3T3-L1 MBX 细胞分化而来的脂肪细胞用异丙肾上腺素 (25nM) 和胰岛素 (150nM) 的组合处理。处理 90 分钟后,从每个孔中取出培养基样品并使用 Glycerol-Glo™Assay进行检测。每个条件一式三份进行测试,误差线代表标准偏差。
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在肝病研究中监测脂肪变性
BSA结合的脂肪酸和脂蛋白通过脂肪生成刺激肝细胞内甘油三酯的积累。在本研究中,我们使用Triglyceride-Glo™ Assay来监测人肝脏3D微组织中在不同药物处理条件及时间下甘油三酯的含量。结果表明,Triglyceride-Glo™ Assay可用于监测细胞模型中脂肪变性的进程。
图. 人肝脏微组织中的甘油三酯水平。将 3D InSight™ 人肝脏微组织(MT,InSphero,~1150 个细胞 / 孔)在无血清培养基中孵育3 天和 10 天,培养基含有生理(LG/LI)或超生理(LG/HI)水平的葡萄糖和胰岛素,以及与 BSA 结合的游离脂肪酸(FFA)或低密度脂蛋白血浆组分(LDL)。将微组织在 PBS 中洗涤两次,并根据标准操作方法检测总甘油浓度,将数值绘制为每个微组织(MT)中甘油三酯的浓度。数据由瑞士苏黎世的 InSphero 公司提供。
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小结
Triglyceride-Glo™ 和 Glycerol-Glo™ Assays 为需要测量脂肪分解和脂肪生成的研究人员提供了一种更好的方法。与比色法或基于荧光板的测定相比,它简单、无需洗涤的方案可实现更灵敏的生物发光检测。与繁琐的有机萃取不同,该检测使用快速去污剂裂解步骤来制备脂质样品。这些生物发光检测可以独立使用或补充其他脂质检测方法共同使用。
Promega代谢物检测平台
产品特点:
1. 适用于多种生物样品,如细胞培养基、组织、血清和组织裂解物等。
2. 发光法检测,灵敏度高,线性范围大:检测线性范围高达 80µM。
3. 无需有机萃取、高温或离心。
4. 操作简单,直接在板孔中进行。
甘油三酯检测产品:
甘油检测产品:
胆固醇/胆固醇酯检测产品:
Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay
了解其他代谢物检测方法:
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电话:010-58256268
公司网址:www.promega.com.cn
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