引言

● BRET检测原理为NanoLuc^®萤光素酶与细胞渗透性荧光示踪剂（其可与NanoLuc靶融合蛋白发生结合）之间发生的发光能量转移。

● NanoBRET™靶点相互作用（TE）检测法利用BRET检测原理在多孔板中定量测定化合物与活细胞中靶蛋白的结合亲和力。使用可对BRET信号进行标准化测定的对照实现对化合物占有率的定量测定。

● 由于BRET检测法通过对能量供体（NanoLuc^®）与能量受体（示踪剂tracer）之间的紧密距离限制进行检测，因此NanoBRET™ TE检测法可对与NanoLuc^®融合的靶标进行特异性测定。

• 当配体结合时，EGFR自磷酸化，使得SHP2活化

• SHP2积极地促使RAS形成GTP结合的激活状态

• RAS诱导激活RAF，触发信号级联，磷酸化MEK和ERK等下游蛋白

<除此之外，Promega正在积极地为该通路的其他成员进行靶标结合检测开发>

（A）N-SH2域阻断PTP域的催化位点时发生的自身抑制示意图（无活性状态）。磷酸化蛋白底物（即pTyr）与C-SH2和N-SH2域相结合，从而激活SHP2。

（B）只有SHP2变构抑制剂可在NanoBRET™检测中显示出强大的靶标结合。可能由于SHP2的自抑制构象，PTP催化域抑制剂无法与靶点相互作用。

（A）NanoBRET™ RAS TE检测法示意图。使用分裂萤光素酶（NanoBiT^®）法在HEK293细胞的膜定位RAS多聚体条件下形成萤光素酶供体。细胞渗透性RAS BRET示踪剂发生结合可产生BRET报告基因，RAS配体与示踪剂竞争破坏BRET信号。

（B）对于SI/II口袋配体（例如BI-2852和前体片段），可以观察到正性靶点相互作用。

（A）可以观察到SII口袋的变构靶标结合，其效价值与表型检测（例如检测KRAS（G12C）驱动细胞系中的p-ERK抑制）所获得的效价结果之间密切相关。

（B）RAS TE检测法可对多种RAS变体进行检测，包括KRAS WT、HRAS WT和热点突变（例如KRAS G12、Q61和G13），因此可进行选择性分析。

（A）采用 NanoBiT^® 方法以 RAF 异源二聚体形成萤光素酶供体，RAF 异源二聚体是由共表达 KRAS(G12C)来诱导的。包含BRAF或CRAF的A-F假激酶突变体，可阻断示踪剂与一个原聚体结合，使得第二个原聚体可用作测定TE。

（B）可测定RAF二聚体粘合剂如LXH254的RAF原聚体选择性。

（C）ARAF原聚体的结合效力与RAF二聚体结合剂的MAPK通路抑制相关性最强。

（A）具有活性的KRAS突变体（例如KRAS(G12C)）的共表达使得下游MAPK通路成员对于靶标结合更为敏感。

（B）MEK1靶标结合检测可测定I型ATP竞争性抑制剂和变构抑制剂（例如曲美替尼）的TE。

（C）同样可进行ERK的靶标结合检测。

• 检测量化了SHP2的变构抑制剂的相互作用，但未能量化PTP催化域抑制剂。

• 该检测法可对KRAS、HRAS和多种临床相关热点突变进行高质量测定。

• 测定RAF二聚体的TE和同源基因的选择性

• 在突变KRAS存在的情况下测定下游MAPK通路成员的TE

• MEK的TE检测可测定I型ATP竞争性抑制剂和变构抑制剂的相互作用。