专业洞察:展望生物发光活体成像的多重标记技术
在过去的几十年里,生物发光活体成像(BLI)技术取得了显著进展,其未来发展趋势持续增强。该技术对整个动物体内内源性生物过程的成像提供了一种非侵入性的方法,能够更简单地评估相关的系统和功能。
关键词:生物发光成像,报告基因多重标记,Firefly,NanoLuc®萤光素酶(NLuc),活体成像新型底物fluorofurimazine(FFz)。
01
生物发光活体成像工具
与荧光成像不同,BLI依赖酶与底物的结合产生发光信号,极大地降低了背景噪声(Refaat et al., 2022)。传统的荧光标签通常较大,可能干扰正常的生物学功能。活体BLI研究已存在一段时间,主要采用的是萤火虫萤光素酶(Luc2/luciferin)。近期的一项重大突破是研发出小巧且亮度高的NanoLuc®萤光素酶(NLuc)。Promega公司提供了丰富多样的NLuc系列产品,可用于基因、蛋白质动力学以及蛋白质-蛋白质相互作用的研究。为了充分理解这些工具的强大潜力,我们采访了几位关键研究人员,探讨他们对活体BLI未来发展的看法,特别是关于NLuc与Firefly萤光素酶(FLuc)实现多重标记的可能性,以及未来的研究方向。其中两位受访专家分别是Promega公司的高级科学研究员Thomas Kirkland博士和Erasmus MC大学医学中心的副教授Laura Mezzanotte博士。
02
在生物发光活体成像中,NanoLuc®的多重标记应用
NanoLuc®萤光素酶(NLuc)因其多种特性,在活体模型研究中极具吸引力。仅19kDa的小分子量使其成为一种高效标签,对生物功能影响极小。此外,NLuc无需依赖ATP,这为评估如外泌体等传统上难以检测的领域开辟了新的可能。Promega公司最新开发出fluorofurimazine(FFz)作为适用于活体内检测NLuc的理想底物。NLuc的独特性质使其在活体研究领域占据独特地位。
在活体实验中,一个激动人心的应用方向是将NLuc与其他报告基因进行多重标记,例如与萤火虫萤光素酶(FLuc)结合使用。FLuc及其底物萤光素在过去几十年里一直是活体BLI领域的主导者(Kim et al., 2015)。然而,NLuc/FFz的多重标记技术进步显著,使得这两种报告基因系统各自具有特定的应用场景。Tom对此进行了详细阐述:“由于NLuc与BLI中常用的主流酶FLuc完全正交,因此特别适合用于多重标记。它们的底物完全双向正交——每种底物只有在其对应的萤光素酶作用下才会发出光,且无交叉反应。”
除了不存在底物交叉反应之外,FLuc和NLuc之间的明显差异也为多重标记带来了多个优势。Tom强调说:“NLuc/FLuc多重标记的最佳用途在于,能够充分利用各自萤光素酶的优势。FLuc因在细胞内具有极高的活性且其底物萤光素可以大剂量注射,非常适合用来指示肿瘤大小。而NLuc则在细胞内外均具有活性,并且亮度极高,因此可用于例如在免疫肿瘤学实验中标记T细胞,或者标记治疗性抗体。”
Promega公司可提供适用于活体内检测NanoLuc®和Firefly萤光素酶的底物产品。
萤光素酶 |
名称 |
目录号 |
规格 |
NanoLuc® 萤光素酶 |
Nano-Glo® Fluorofurimazine In Vivo Substrate (FFz) |
N4100 N4110 |
1 each 5 each |
Firefly 萤光素酶 |
VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade |
P1041 P1042 P1043 |
50mg 250mg 1000mg |
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03
活体BLI中的关键考虑因素
Laura强调,在充分利用报告基因进行实验时,需要注意一些重要的事项:“你必须仔细检查光发射的动力学曲线,这会因你想成像的组织类型而有所不同。” 多种因素对整个动物体内不同报告基因的成功应用有着显著影响。对于深部组织而言,蓝色光的发射很难到达表面,为解决这一挑战,已开发出将NLuc与红色或橙色报告基因(如Antares [CyoGFP])融合的新型报告子(Su et al., 2020)。
当使用多种报告基因进行活体研究时,Laura强烈建议进行纵向研究,并指出:“最好做动力学成像,在纵向研究结束时,你会获得更为全面的数据。”由于新底物fluorofurimazine(FFz)毒性降低,NLuc的纵向活体研究得到了极大改善。Tom指出总体来说,“相比于其他海洋萤光素酶如Renilla,NLuc具有更优越的性能,因为它亮度更高,且能有效利用比腔肠素更具药代动力学特性的底物,例如fluorofurimazine(FFz)”。
参考文献
Kim, J. E., Kalimuthu, S., & Ahn, B. C. (2015). In Vivo Cell Tracking with Bioluminescence Imaging. In Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Vol. 49, Issue 1, pp. 3–10). Springer Verlag.
https://doi.org/10.1007/s13139-014-0309-x
Refaat, A., Yap, M. L., Pietersz, G., Walsh, A. P. G., Zeller, J., del Rosal, B., Wang, X., & Peter, K. (2022). In vivo fluorescence imaging: success in preclinical imaging paves the way for clinical applications. In Journal of Nanobiotechnology (Vol. 20, Issue 1). BioMed Central Ltd.
https://doi.org/10.1186/s12951-022-01648-7
Su, Y., Walker, J. R., Park, Y., Smith, T. P., Liu, L. X., Hall, M. P., Labanieh, L., Hurst, R., Wang, D. C., Encell, L. P., Kim, N., Zhang, F., Kay, M. A., Casey, K. M., Majzner, R. G., Cochran, J. R., Mackall, C. L., Kirkland, T. A., & Lin, M. Z. (2020). Novel NanoLuc substrates enable bright two-population bioluminescence imaging in animals. Nature Methods, 17(8), 852–860.
https://doi.org/10.1038/s41592-020-0889-6
04
未来展望
Tom和Laura都对NLuc未来在生物发光活体成像领域的应用充满信心。访谈中,Laura回忆起看到NLuc用于分析病毒时感到非常激动,并笑着补充说她最近看到了关于这个主题的确切出版物。当被问及期待在哪些领域看到NLuc的应用时,Laura表示她对“抗体标记、粒子追踪以及内源性标签”等领域充满期待。尽管Laura已经过渡到使用类器官配合NLuc开展工作,但她指出她看到了探索动物大脑的很大潜力。
Tom通过他在Promega内部开发FFz的工作,与NLuc产生了紧密合作。当被问及他所关注的研究领域时,他回应道:“我期待看到超越细胞追踪的应用。生物发光成像可以用于通过萤光素酶传感器(NLuc特别适合这一领域)、生物发光共振能量转移(BRET)和前体底物检测相互作用和酶活性。所有这些都可以通过基于NLuc的系统来检测,其中的一个挑战是信号标准化。这可以通过FLuc作为正交、普遍分布的报告基因相对容易地完成。”
来自Laura和Tom等该领域专家的洞察力突显了活体BLI背后的兴奋和势头。随着诸如FFz等最新进展的出现,多重标记技术为理解复杂的生物过程开辟了新的途径。
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Promega Corporation是一家为生命科学行业提供高质量解决方案和技术支持的全球领先生物技术企业。在其44年的历史中,Promega已建立了包含有4000多种支持细胞和分子生物学的目录产品和定制产品的组合。如今,Promega开发的萤光素酶(即荧光素酶)等技术推动了活细胞分析、药物发现、分子诊断和人体识别等领域的创新,并且由实验室科学家和技术人员用于学术和政府研究、法医学、制药、临床诊断以及农业和环境检测。Promega总部位于美国威斯康星州麦迪逊市,在16个国家设有分公司,拥有50多家全球经销商。如需获取更多信息,请访问www.promega.com。
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