让我们来看一个通过NanoBiT^®检测蛋白质：蛋白质相互作用的例子。NanoBiT^®的工作原理是将NanoLuc^®萤光素酶分成两个亚基，大亚基 (LgBiT) 和小亚基 (SmBiT)。这两种蛋白质之间的亲和力很低，当它们彼此靠近时，LgBiT和SmBiT会重组形成萤光素酶并产生可测量的信号。这种非裂解性检测方法提供了一种灵敏地实时量化动态蛋白质：蛋白质相互作用的方式。

研究人员使用这项技术探索G蛋白偶联受体(GPCRs)。他们选择了CX3CR1（趋化因子(C-X3-C基序)受体1），这是一种高度选择性的趋化因子受体，也是细胞毒性效应淋巴细胞的表面标记。了解GPCRs与β- Arrestin 2（ARRB2）的相互作用，有助于更好地理解通过受体招募的炎症性疾病的机制。

研究使用稳定表达CX3CR1融合SmBiT和ARRB2融合LgBiT的HEK293细胞来探索这个GPCR（如您对该细胞系感兴趣，可与Promega联系）。这些细胞被不同剂量的Fractalkine（一种CX3CR1激动剂）处理。用Fractalkine处理会导致与ARRB2（β-arrestin 2）结合，并引发受体招募。图1展示了在用不同剂量的Fractalkine处理后，以剂量响应方式生成的NanoBiT^®萤光素酶信号。这些结果与之前发表的相同细胞的研究一致。

图1：CX3CR1和ARRB2的蛋白质-蛋白质相互作用对Fractalkine剂量的响应

这些数据非常有用；然而，它并不能完全表明CX3CR1在与ARRB2结合后的内吞过程。为了确认信号确实指示了受体的内吞作用，研究人员使用了生物发光成像。

很明显，NanoBiT^®技术提供了一种强大的方法，通过生物发光信号来检测蛋白质：蛋白质相互作用。然而，这种基于平板的测定无法显示蛋白质的细胞内运输是否产生了生物发光。为了可视化信号和内吞作用，研究人员将HEK293细胞以每孔60-75K个细胞的密度接种，并在无菌条件下培养过夜。第二天早上，研究人员小心地用Opti-MEM替换培养基，并将细胞血清饥饿处理5小时，然后用10nM的Fractalkine处理细胞。

图2显示了在GloMax^® Galaxy细胞成像仪上收集的图像视频。总的采集时间为24分钟。每个图像捕捉的是一个3分钟的曝光时间。视频开始时没有显示任何细胞，这表明在使用Fractalkine处理之前没有生物发光。用10nM Fractalkine处理后，很快就会看到生物发光信号增加，这表明了CX3CR1:ARRB2相互作用的发生。仔细观察视频可以发现，发光信号的位置从主要集中在细胞膜逐渐转移到细胞内部，看起来更像是点状分布。这个短时间内信号位置的变化表明，在CX3CR1:ARRB2相互作用之后发生了受体内吞。

总之，在实际应用中，生物发光成像使您能够最终捕捉到数据的细微之处。GloMax^® Galaxy不再是对整个孔板产生的信号进行分析，而是提供了一种在细胞水平上观察信号的方法。成像能够区分响应性细胞和非响应性细胞，揭示处理对单个蛋白质相互作用的影响，并帮助确定这些相互作用在细胞群体中的发生速率是否一致。通过提供对生物事件的实时洞察，GloMax^® Galaxy不仅帮助您收集数据，更让数据变得生动而直观。

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