HiBiT标签蛋白的免疫检测

HiBiT是一个由11个氨基酸构成的肽标签，可以使用传统克隆技术或CRISPR/Cas9基因组编辑技术连接到目的蛋白中，使其能够在内源性表达条件下分析蛋白质。HiBiT标签蛋白通常通过添加Nano-Glo^® HiBiT检测试剂产生的生物发光信号进行检测，从而在线性动态范围内（＞7个数量级），对变化的蛋白质水平，进行准确定量。兼容高灵敏度和特异性的Anti-HiBiT Monoclonal Antibody，扩充了HiBiT标签蛋白的检测，使传统的基于抗体的方法可以检测HiBiT标签，无需串联标签方法。

利用免疫印迹特异性检测低于皮克级的HiBiT

Anti-HiBiT Monoclonal Antibody兼容高灵敏度和特异性，能够在免疫印迹中，在极低的背景下，检测低于皮克级的HiBiT标签蛋白。 利用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody进行免疫印迹分析具有灵敏度高且特异性强的特点。在K562哺乳动物细胞裂解物中连续稀释HaloTag®-HiBiT蛋白，生成0.125~4pg的HiBiT标签蛋白。经过SDS-PAGE后，将凝胶转移至PVDF膜上，使用1µg/ml的一抗、0.2µg/ml的HRP偶联二抗以及ECL免疫印迹底物进行免疫印迹分析。成像60分钟，亮度1200~15000。

CRISPR/Cas9 HiBiT敲入后的亚细胞定位

使用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody进行免疫荧光染色，可对HiBiT敲入细胞系池和细胞系克隆进行表征，证实内源性表达的HiBiT标签蛋白其亚细胞定位符合预期。

利用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody在CRISPR编辑的细胞系池和细胞系克隆中进行HiBiT标签蛋白的免疫荧光检测。CRISPR/Cas9编辑用于在具有不同亚细胞定位的蛋白质的内源性位点处敲入HiBiT。利用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody（红色）和Hoechst染料（蓝色）进行免疫荧光染色，再利用免疫荧光染色对固定的CRISPR修饰的细胞系克隆或细胞系池进行成像，包括图A：VCL-HiBiT池、图B：HDAC2-HiBiT克隆、图C：SMARCA4-HiBiT 克隆、图D：HSP90B1-HiBiT池。

抗HiBiT抗体与普通表位标记抗体效果相似或更优

HiBiT标签蛋白的免疫印迹检测和免疫沉淀表明，当使用普通抗体时，HiBiT标签蛋白的特异性检测和有效pull-down分析效果与FLAG^®、Myc或HA标签相似，或是更优。

将使用Anti-HiBiT Monoclonal Antibody的免疫印迹检测与使用普通表位标签抗体进行比较。利用单独的HiBiT或HiBiT和单个拷贝的Myc、HA和FLAG^®标签，或三个拷贝的FLAG^®标签，将HSP90B1在HeLa细胞的C端进行标记。通过SDS-PAGE分离来自带标签的HSP90B1细胞池的裂解物（10µg）。转移到PVDF膜后，用1µg/ml抗-HiBiT或抗-Myc、0.1µg/ml抗HA或10µg/ml抗FLAG^®一抗（如图所示）和0.4µg/ml抗小鼠或抗大鼠（用于抗HA印迹）二抗和ECL底物进行免疫印迹，曝光时间为5分钟。HiBiT抗体成像的亮度为0~29817，所有其他成像的亮度均为145~735。

比较CRISPR修饰的细胞系池的pull-down效率。CRISPR/Cas9基因编辑用于将HiBiT、HiBiT FLAG、HiBiT-3XFLAG、HiBiT-HA或HiBiT-Myc敲入 HSP90B1蛋白内源性位点的C端。用缓冲液将CRISPR编辑的HeLa细胞系池裂解物进行稀释，随后进行分离，生成等效样本进行pull-down比较分析。使用2µg抗-HiBiT、FLAG^®、HA或Myc抗体（如图所示）与蛋白G磁性树脂(Cytiva) 对HSP90B1蛋白进行免疫沉淀反应。经过2小时孵育后，清洗树脂，通过在SDS加样缓冲液中加热洗脱蛋白质。使用Nano-Glo^® HiBiT Blotting System，对细胞裂解物中免疫沉淀的HSP90B1标签蛋白进行定量检测。显示了洗脱的蛋白质和保留在上清液中的蛋白质。通过比较抗体处理后的上清液与起始样本中的信号强度表明了抗体的蛋白清除效率。