检测化合物对多聚体 RAS 的亲和力和占有率

NanoBRET™ TE Intracellular RAS Assay是一种新型方法，用于检测化合物对 RAS 蛋白的细胞内结合，该蛋白是一类在人类癌症中经常发生突变的 GTP 酶。该检测方法基于 NanoBRET™ TE 技术，这是一种专为检测活细胞中分子接近程度而设计的能量转移技术，可用于量化多个 RAS 变体（包括 KRAS、HRAS 和相关突变体）的化合物亲和力和占有率。与使用 NanoLuc^® 萤光素酶靶点融合蛋白作为 BRET 供体的方法不同，NanoBRET™ TE Intracellular RAS Assay使用 NanoLuc^® Binary Technology（NanoBiT）来检测多聚体 RAS 的细胞内靶标结合。

NanoBRET™ TE RAS 测定的工作原理
NanoBRET™ TE Intracellular RAS Assay使用 NanoBiT^® 技术，这是一种由大萤光素酶亚基（LgBiT）和小互补肽（SmBiT(q)）组成的结构互补系统。具体来说，LgBiT -全长 RAS 的融合蛋白与 SmBiT(q) -全长 RAS 的融合蛋白在细胞中共表达。当 RAS 蛋白产生相互作用并形成多聚体时，LgBiT 和 SmBiT(q) 亚基聚集在一起形成作为 BRET 供体的活性萤光素酶。能量受体是一种可渗透细胞的荧光 NanoBRET™ tracer，专门与 RAS 结合。与 RAS 结合的化合物的添加会导致tracer的替换和剂量依赖性 BRET 信号的下降。

在NanoBRET™ TE Intracellular RAS Assay中的NanoBiT^®系统使用独特的SmBiT(q)肽，使NanoBiT^®萤光素酶对Extracellular NanoLuc^® Inhibitor敏感。这种抑制剂抑制了来自受损细胞和细胞碎片的信号，确保NanoBRET™信号来源于活细胞。

检测多个RAS变体中的正交和变构RAS配体
NanoBRET™ TE细胞内RAS检测可用于检测多种RAS蛋白（包括野生型和突变型KRAS/HRAS）的化合物细胞亲和力和占有率。该检测可以检测化合物与switch I/II口袋和switch II口袋的结合。

KRAS(G12C)的正交和变构抑制剂的细胞内靶标结合。NanoBRET™TE RAS Assay用于定量分析表达SmBiT(q)-KRAS(G12C)和LgBiT-KRAS(G12C)融合载体的HEK293细胞中RAS抑制剂的细胞内靶标亲和力。测量了针对开关I/II口袋结合剂BI-2852、共价开关II口袋结合剂Sotorasib和Adagrasib以及非共价开关II口袋结合剂MRTX1133的表观亲和力。

不同RAS变体的化合物选择性。NanoBRET™ TE RAS Assay允许使用相同的工作流程和2µM的恒定tracer浓度，对测试化合物在多个RAS变体中的选择性进行评估。这里显示的是Sotorasib（图A）和MRTX1133（图B）在全套可用的RAS融合载体中的选择性曲线图。Sotorasib对G12C热点RAS突变体具有强烈的选择性，而MRTX1133可有效作用于其预期靶点KRAS（G12D）和许多其他KRAS变体。