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Q:一个或多个通道中有额外的杂峰出现?

原因及参考建议:


1. 扩增的非特异峰。过量的纯化模板会引起更多的非特异峰。建议使用推荐量的模板。如果选择小体系扩增,模板量需要被优化。
2.  扩增产物被扩增级的水稀释。推荐提取后进行定量后再进行扩增,以优化目标模板。如果必须稀释扩增产物,使用PCR缓冲液,例如1X Master Mix。使用PCR缓冲液在进样过程中能起到一定的缓冲作用。
  • 3. 被其他模板DNA或先前存在的扩增产物污染。可能存在交叉污染,应该使用防回吸加样枪头,并及时更换手套。

  • 4. 样品变性不完全。在电泳之前,按照建议的时间将样本充分变性,并迅速置于碎冰、冰板或者冰水浴中充分冷却,然后及时上样电泳。不要把样品放在设置为4℃的扩增仪冷却,这样可能使DNA复性而出现非特异性带。

  • 5. 不要长时间保存PCR扩增混合物。准备好混合物后,立即将混合物添加到反应板的孔中。

  • 6. 在电泳过程中双链DNA的迁移速率要大于单链DNA。影子峰的出现,尤其是在距离杂合子主峰等距离处出现的影子峰,提示可能由于变性不完全或进样后复性导致双链DNA的出现。

  • 7. STR扩增的杂峰。由于STR扩增时的3'端加A不完全,可能在主峰前出现一个比主峰少一个碱基的影子峰。

  • ○ 确保热循环后60℃再延伸10分钟。

  • ○ 减少DNA模板量。使用大于推荐量的DNA模板会使加A不完全。

  • ○ 减少循环数。

  • ○ 增加再延伸的时间。

  • 8. 电泳相关的杂峰(尖刺峰)。微小的电压变化或者经过激光源时的晶体可能会引起“尖刺峰”或者意外峰出现。尖刺峰有时会出现在一个荧光通道中,但经常在多个荧光通道中出现。应重新电泳样本。

  • 9. 拉升或渗透。当峰值过高或应用与样本的Matrix质量不高或不正确时,就会产生拉升现象。

  • ○ 需要进行一次新的光谱校正,然后重新电泳样品。

  • ○ 不同的仪器灵敏度会有所差异,需要优化进样条件。

  • ○  重新启动3500或者3500xl遗传分析仪和相连的电脑。重新进行光谱校正。在3500或者3500xl遗传分析仪进行光谱校正电泳时设置为不能借用。

  • 10. 利用新鲜的甲酰胺重新准备样品。将扩增产物长时间保存在甲酰胺里会导致杂峰出现。

  • 11. 电泳使用的聚合胶超过保质期,或者将聚合胶在室温放置时间超过一个星期。

  • 12. 按照用户使用手册推荐的操作,每天或每周进行仪器的维护。

  • 13. 胶引起的杂峰。不同的胶有不同的迁移速率及位点位置,如果不使用产品说明书中对应的胶类型,需要经过实验室内部优化和验证。




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