回答：

• 实验前用户需提供的材料

1. Kinase Enzyme System(KES)套装:  KES + ADP-Glo™ Kinase Assay ； 或单独的KES  (10µg或1mg规格系统)， ADP-Glo™ Kinase Assay  (Cat. # V9101等)，或ADP-Glo™ Max Assay (Cat. # V7001等)。如果不使用Kinase Enzyme System，客户需自己准备纯化的激酶，激酶底物，和适合所用激酶的反应缓冲液。

2. 无核酸酶水；可购买商品化的无核酸酶水，例，Promega 目录号P1195；如果自己制备，请确保达到相对应的质量级别。

3. 待测化合物，及对应的溶剂（例如，Staurosporine，与对应溶剂DMSO）。

4. 用于制备标准品、激酶滴定样品、抑制剂滴定样品的透明 96孔、384板、或EP管；需要无菌无核酸酶污染，根据实际需要的试剂体积决定规格。

5. 用于发光检测的白色不透明聚苯乙烯未处理平底96孔或384孔板 （不可使用表面处理过的，黑色或透明检测板）。

*我们测试过可用的型号举例：

regular 96 well solid white plates，Corning Costar #3912

half-area 96 well solid white plates，Corning Costar #3693

regular 384 well solid white plates，Corning Costar #3572

384 well Low Volume (LV) solid white plates，Corning Costar #4512

white 96 MicroWell^® plates, Nunc Cat. # 236108

6. 多通道加样器或自动移液工作站。

7. 微孔板振荡仪和可离心孔板的离心机，用于收集和混匀试剂。

8. 可读取多孔板的化学发光检测仪，例如GloMax^® Discover System，目录号GM3000

o 实验操作注意事项概述

1. KES系统Application Note以常规384孔板激酶反应为例，实际使用时可按需等比例增减反应体系，确保 Kinase reaction：ADP-Glo™ Reagent ：Kinase Detection Reagent 的体积比为 1:1:2。注意：反应体系越小，操作带来的误差越明显，结果重复性和稳定性会不如大体系（例如标准96孔板反应）理想。当使用384孔板进行实验出现这类问题时，可尝试换用96孔板反应体系。

2. 每个KES对应的Application Note中，激酶检测使用的ATP浓度是与已发布的其同一类激酶家族ATP Km值范围最接近的浓度。我们建议您使用该ATP浓度来进行激酶滴定和抑制剂滴定实验。Application Note中Figure 2是该ATP浓度下的ATP-ADP转化曲线示例，示例结果不可用于实际实验中ADP产生量的计算。

3. 以下情况，我们建议您建立ATP-ADP转化曲线：

1） 第一次使用ADP-Glo™ 试剂盒 ，或开启一个新的ADP-Glo™ 试剂盒 ，或间隔较长时间后重新启用之前使用过的ADP-Glo™试剂盒 ，我们都建议您在激酶滴定或抑制剂滴定实验之前或同时，建立对应浓度的ATP-ADP转化曲线，确保您的操作和试剂是正常工作。

2） 为了评估在激酶反应中产生的ADP的量，需要每次激酶检测的同时创建一条对应浓度的ATP-ADP转化曲线；不同ATP浓度的激酶反应需要各自建立对应浓度下的ATP-ADP转化曲线来计算ADP的生产量。

3） 激酶检测的背景信号水平取决于所用ATP的浓度，每个ATP浓度不同的激酶反应背景值会有差异，如果激酶滴定或抑制剂滴定实验中怀疑背景值异常，建议通过同时建立转化曲线来进行原因排查。

4. 进行该检测时，仅使用试剂盒中提供的超纯ATP进行激酶反应。其他来源的ATP可能会含有ADP污染，导致背景升高灵敏度降低。

5. 激酶反应（激酶滴定或抑制剂滴定）与对应的转化曲线应当使用同一份ATP储备液来配制，并在同一块不透明的白色平板上检测。

6. 第一次使用某个KES，或开启一个新收到的KES，以及间隔较长时间后重新启用之前用过的KES，建议先进行激酶滴定，计算SB10，以确定后续用于抑制剂的滴定或筛选的最佳酶用量。注意：SB10定义为产生的信号背景比为10倍时所需要的酶的数量， SB10值通常是产生体现激酶反应初始速率的百分转化率所需的激酶量，通常产生5%-10%的ADP转化。我们建议使用SB10的酶量进行后续实验，但您也可自行调整酶用量，使用更低的酶量会压缩反应窗口，更高的酶量能增大窗口但也会增加经济成本也可能降低抑制剂的效能。

7. 每个KES对应的Application Note中，Table1 和 Figure 3.A为激酶滴定的示例结果。您可以参考这个示例调整激酶滴定的起始浓度和稀释倍数，但具体的激酶用量需要进一步优化。我们不建议您直接使用示例中SB10进行实验，因为不同批次酶的活力会有差异，并且您实际的操作、反应条件、检测耗材、检测仪器，都会影响SB10的实际结果。

8. Figure 3中还展示了示例反应中的底物浓度，这可以作为一个很好的起始用量。如果您想要获得更好的反应窗口，那么应当进一步优化使用的底物浓度。固定ATP和激酶的用量（SB10），对底物浓度进行滴定，最优的底物用量会导致含激酶的反应孔与不含激酶的对照孔产生的发光信号差异最大。

9. ADP-Glo™ Kinase Assay需要在室温进行（22-25℃），为了更好的重复性，可以选择固定温度进行每一次检测（23℃）。为了避免整个检测板产生温度差，我们建议优先选择在室温条件下优化激酶反应条件（调整反应时间或反应成分用量）。若需提高反应温度（例如30℃或37℃）来优化激酶反应，在进行ADP-Glo™ Kinase Assay前，务必平衡反应板上所有的样品孔到室温。

10. 激酶反应中的缓冲液环境可能会改变背景发光。除了实验研究的变量，所有的反应（背景孔、实验孔、标准品孔）中都应当包含相同的1x浓度的缓冲液成分和其他所有成分（例如，化合物溶剂）。1x浓度的缓冲液成分可以在对应的Application Note第二页底端找到。所有反应中都应当含有相同终浓度的化合物溶剂，该流程中以Staurosporine 为待测化合物，其溶于100% DMSO，最终所有反应中均含有1% DMSO。您应当根据自己的待测化合物准备对应的溶剂对照，并调整其在最终反应中的浓度。

11. 每个KES对应的Application Note中， Figure 3.B为Staurosporine或对应激酶的特异性抑制剂滴定曲线。您可以使用该示例作为相应激酶的抑制剂实验阳性对照。

• 试剂保存和操作注意事项

1. 激酶系统（Kinase Enzyme System）所有组分均保存在-65℃以下。每次使用时，冰上彻底地解冻所有组分。使用前瞬时离心收集试剂到管底并混匀。

1） 为了获取最佳的存储效果，第一次使用时，在冰上融化激酶、底物，轻柔混匀并离心，将其分装成小份，将本次实验不用的部分马上放回-65℃以下。激酶和底物应当避免反复冻融和重复操作。

2） 激酶是非常脆弱的蛋白质，很容易失去活性，请分装以避免反复冻融；同时，避免反复处理，激酶尽量限制吹打混匀次数不超过7-8次，可通过轻柔弹拨、瞬时离心、微孔板振荡仪进行混匀。

2. ADP-Glo™ Kinase Assay 或ADP-Glo™ Max Assay可以整体保存在-20℃。每次使用前，在室温彻底融化所有组分，并充分混匀。

1） ATP经过冻融循环后容易自然水解，建议第一次融化混匀后分装成单次使用的等分液，并在-20°C存储，为了获取最可靠的存储效果，最好保存在-65℃以下。 ATP水解会显著增加检测背景。

2） 按照产品对应说明书描述配制Kinase Detection Reagent。Kinase Detection Buffer可能由于冻存产生沉淀，虽然沉淀不会影响试剂性能，但可能在之后的实验中会有堵塞移液器吸头的风险，所以需要溶解或去除沉淀。操作方法：室温解冻Kinase Detection Buffer，观察是否有沉淀存在。如果有，在37°C恒温孵育并不间断地晃动15分钟，可以使沉淀溶解；或，瞬时离心完全溶解的Kinase Detection Buffer，小心地只将上清转移到Kinase Detection Substrate所在的容器中。

3） 为了获得最佳性能，Kinase Detection Reagent配制好后应当立即使用，或分装成小份冻存在-20℃。我们测试过Kinase Detection Reagent可以耐受不超过10次冻融循环。

4） 为了获得最佳性能，ADP-Glo™ Reagent可以在第一次使用时，混匀后分装成小份冻存在-20℃。我们测试过ADP-Glo™ Reagent可以耐受不超过10次冻融循环。

3. 所有试剂分装用容器和耗材应当是无菌、无核酸酶、非处理表面（避免高吸附性能的材质）。操作过程中注意混匀和避免污染。

4. 稀释后的Reaction Buffer A (5X)、ATP、ADP等需当次使用，不应当保存后重复使用。