Q:双报告数据处理
相对光强度 RLU = relative light units
使用者通常想了解到底怎样的背景值或者基础值才是“正确的”。实际上，并不存在一个绝对的“正确值/范围”。Relative light units（RLU）是仪器收集到样品中的发光信号后，通过计算得到的一个相对光强度，而不同的仪器使用不同的计算方法和感光元件。因此，原始的RLU数值在不同的仪器间会相差颇多，即便使用相同的实验模型，也不能直接进行比较。更有效的判断方法，是用转染了报告基因载体的细胞与未转染的细胞（即背景对照组）的检测数据进行比较。在数据重复性很好的情况下，有效的实验组（转染组）RLU值，一般要求至少大于背景孔RLU值的均值加三倍的标准差，称为Minimum Detectable Level (MDL)，说明实验组的确有萤光素酶反应发生。当然，实验组与背景值的RLU差异越大，对于实验分析来说越方便和可信。原始的RLU数值的上限，不应当超过仪器的检测上限，即整个实验中，读值最高的一组也应当在仪器的读数范围内。使用白色不透光的平板来进行检测，因为它可以提供最佳的信号和最低的信号干扰（避免光泄漏到相邻孔中）。仪器的检测动态范围和灵敏度是检测极低或极高信号时的一个关键限值因素。
使用一台灵敏的仪器检测时，空白孔和实验孔的读值会有明显的区别。
背景值的扣除Background Subtraction
因为真核细胞没有内源表达的萤光素酶或自发光物质，所以实验中的背景值主要来自发光检测仪，检测板/管和萤光素酶底物。甲虫萤光素是一种高效的萤火虫萤光素酶底物，在样品中不存在萤火虫萤光素酶的情况下不会发光。海肾萤光素酶的底物，腔肠素，可以在没有萤光素酶的情况下在溶液中被氧化而自发光。但是，Stop & Glo® Reagent和Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent均使用一种专有的试剂配方，可以最大程度地减少腔肠素的自发光。许多发光检测仪都无法测量到来自底物的自发光。为了获得最大的准确性，理论上每个实验组（包括对照组）都应当减去背景组的萤火虫和海肾萤光素酶的发光测量值。但大多数情况下，萤光素酶反应产生的发光值远高于背景值，因此萤光素酶活性与总的发光值成正比，实际上没有必要扣除背景值。但是，当检测非常少量的萤光素酶活性时，减去背景信号非常重要。背景对照应当是不转染的细胞，包含与实验组完全相同的培养液/血清组合，并加上完全相同的检测试剂。
主报告基因与内参基因的相对活性比值
Ratio of Experimental/Control Reporter Activity
过去，研究者通常使用单萤光素酶报告基因系统来监测遗传调控元件的功能，因为其操作简单而且反应灵敏。但是，单报告基因系统无法区分信号的变化是来自对报告基因的特异调控，还是细胞整体事件的结果（增殖、凋亡、坏死等）。双萤光素酶报告基因系统中引入一个内参报告基因，这个基因在细胞中组成型表达，理论上表达水平不受实验处理因素的干扰。将实验报告基因（主报告基因）的表达与对照报告基因（内参报告基因）的表达进行归一化，可以帮助区分特异性和非特异性细胞反应，以及不同样品的转染效率。在一个实验中，主报告基因和内参报告基因的种类并不是固定的，所以如何处理数据应当依据具体的实验设计而定。举例来说，如果用萤火虫萤光素酶（F）作为主报告基因，以海肾萤光素酶（R）作为内参报告基因（例如E1330 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector），那么数据归一化就应当是Ratio=F/R；反之，如果海肾萤光素酶是主报告基因（例如C8021 psiCHECK™-2 Vector），那么就应当是ratio=R/F。这个比值的绝对值，也就是两种酶的活性的相对大小，取决于两种萤光素酶各自的表达量，没有一个明确的范围。不同的实验中得到的结果，通常无法直接比较，要根据实际的实验设计，通过设置合理的实验组和对照组进行分析。有一点需要注意的是，不论是Dual-Luciferase® Reporter Assay System（E1910），还是Dual-Glo® Luciferase Assay System（E2920），都需要通过Stop & Glo® Reagent和Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent淬灭萤火虫萤光素酶反应的发光信号，再读取海肾萤光素酶反应的发光值。这两个系统中，试剂对于第一个光信号的淬灭强度分别是至少105（E1910）和104倍（E2920）。所以，当F/R值大于1000（E1910）或大于100（E2920）倍时，淬灭后残留的Firefly信号就会明显干扰Renilla读值。这时候，就需要考虑调整两个报告基因的转染比例或内参基因使用的启动子。
更多的数据处理建议，请参考对应产品的技术手册。
