去内毒素质粒大提试剂盒PureYield™ Plasmid Maxiprep System（A2392/A2393）使用注意事项

质粒提取前的细菌准备：

1.    准备起始培养物：从含抗生素的新鲜LB培养平板上挑取单菌落，接种到 2–10 ml含有抗生素的LB 培养基中。37°C培养约8小时，剧烈振摇 (~300 rpm)，使细菌达到对数生长期。

2.    把起始培养物以1：500稀释接种到更大体积的含有抗生素的LB 培养基中（例如，取0.5ml起始培养物加到250ml含抗生素的LB培养基中）。使用的培养瓶容积至少是培养基体积的5倍以保证通气充分。37°C培养12–16小时，剧烈振摇 (~300 rpm)。对高拷贝质粒而言， OD₆₀₀=2.0-4.0说明细菌生长达到了合适的密度，可以收获用于提取质粒DNA。注意在测量OD₆₀₀时，如果读数过高，那么应该用细菌培养基稀释使OD₆₀₀值处于0.1–0.5的线性区间。

3.    5000 x g 室温（22-25°C)离心10 分钟。弃上清，把离心管倒置于纸巾上去除任何残余的培养基。可把细菌细胞直接用于质粒提取或者保存在-20度。

其他操作注意事项：

1.    确保所有的细菌培养基（包括平板和液体培养基）中都加入新鲜的抗生素以避免细菌培养物中未转化菌过度生长。菌液的biomass要合适 （参考上面“质粒提取前的细菌准备”）。

       细菌培养物不要过老，挑取新鲜菌落扩大培养。尽量用EndA-的大肠杆菌菌株（如JM109，DH5alpha，TOP10等）。

2.    所有操作步骤（包括离心澄清裂解物），都在室温（22-25度）进行。所有溶液也都在室温保存。

3.    Cell Lysis Solution中含有SDS，在温度低时容易形成沉淀。使用前仔细观察，如发现有沉淀形成，可在37°C温育使沉淀溶解后再使用，否则会影响裂解效果。

4.    用Cell Resuspension Solution重悬细胞时通过涡旋振荡或枪头吹吸使菌体彻底悬浮，不要有任何细胞团块。

5.    为了便于观察细胞裂解和澄清的情况，可以将重悬后的细胞转移到50ml的离心管中，再进行后续的裂解、中和以及离心澄清等操作。

6.    加Neutralization Solution后，用固定角转子离心机室温15000g离心15分钟，可去除绝大部分蛋白沉淀。如离心机达不到15000g，可延长离心时间至30分钟。如一次离心后上清中仍有肉眼明显可见的蛋白漂浮物，可将上清转移至一个新的离心管中再次离心。

7.    使用PureYield™质粒大提试剂盒，过柱时不能采用离心法，必须用真空法，真空泵的压力需达到25.6 inches Hg（与其他压力单位换算关系见产品说明书）。

8.      在使用前，确认Endotoxin Removal Wash和Column Wash中已分别加入所需量的异丙醇和95%乙醇。两种洗液使用后应立即盖紧瓶盖以减少有机试剂的挥发。

9.      洗脱时，加无核酸酶水到结合柱上后，可以静置1-2分钟后再离心或打开真空洗脱质粒。

10.   对>10kb的较大质粒，可预先把无核酸酶水加热到65-70度，再加到结合柱上洗脱质粒DNA，这样有助于提高DNA的得率。