HaloTag ®细胞成像
细胞标记成像简要流程：
细胞成像应用举例：
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HaloTag®技术为在活细胞中和体外进行快速、定点标记HaloTag®融合蛋白提供了新的选择。该技术基于HaloTag®蛋白和合成配基之间形成的共价键，这些配基具有多种功能，包括荧光标记、亲和标记和附着在固相载体上；而共价键在生理条件下可迅速形成，且具有高度特异性和本质上的不可逆，形成的复合物即使在变性条件下也是稳定的。因此，使用HaloTag®只需要一个可以表达的单一融合结构，用任何一种荧光分子标记，即可在活细胞或固定细胞中进行成像。
使用HaloTag®融合蛋白和HaloTag®荧光配基进行细胞成像。您可以对洗涤或未洗涤的细胞进行成像，以确定亚细胞定位。
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HaloTag®配基标记活细胞，之后进行固定。HaloTag®基因与3拷贝核定位序列融合后，稳定转染HEK293细胞，未转染的HEK293细胞作为对照；其中用HaloTag®TMR标记如图A所示，HaloTag® diAcFAM标记如图B所示， HaloTag® Coumarin 标记如图C所示或HaloTag®Oregon Green®标记如图D所示。
2. 研究膜蛋白的定位和运输
使用一种不能进入细胞的荧光配基来标记与HaloTag®蛋白融合的靶标膜蛋白，以此检测受体的运输。HaloTag®报告基因蛋白和配基之间的共价键意味着即使在固定细胞所需的变性条件下，您也可以确定您的蛋白质是否仍然存在于膜中，或者是否发生了周转或内化。这些非细胞渗透性的HaloTag®配基共价结合到HaloTag®蛋白上，您可以在严格的实验条件下分析蛋白质。
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细胞表面HaloTag®融合蛋白的活细胞标记。图 A和B显示的是：稳定表达HaloTag®-ECS(细胞外表面；由信号序列和b1-整合蛋白的单个跨膜结构域组成)融合蛋白的HEK293细胞，使用HaloTag®Alexa Fluor®488配基标记并成像。图 C和D显示的是：表达HaloTag®-EDG1 (GPCR受体)融合蛋白的U2OS细胞，使用Alexa Fluor®660配基标记并成像。共聚焦图像显示，荧光(图A和C)仅限于细胞表面，在DIC/荧光叠加的图(图B和D)也可以清楚地看到。图像是在Olympus FV500共聚焦显微镜上使用适当的滤光片组合生成的。
3. 与免疫细胞化学叠加检测
通过使用Anti-HaloTag® Polyclonal Antibody和一种二抗使得与荧光配基共标记HaloTag®融合蛋白成为可能。确保您的蛋白在体内已被HaloTag®配基特异性标记，尤其是当二抗使用光谱不同的荧光基团进行免疫细胞化学检测(ICC)时。HaloTag®配基可以与活细胞一起使用，然后使用Anti-HaloTag® pAb将细胞固定用于ICC。ICC标记是特异性针对HaloTag®蛋白的，这样可以减少背景着色。
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HaloTag®-p65融合蛋白与HaloTag®TMR配基和Anti-HaloTag®pAb共标记。用5µM HaloTag® TMR配基标记细胞15分钟，轻柔洗涤后用2µg/ml 带有AlexaFluor® 488的抗兔IgG (Invitrogen)孵育。最后，用DAPI (Vector Laboratories)对细胞进行复染。图像用奥林巴斯IX81落射荧光显微镜收集，设置对罗丹明和AlexaFluor®488适合的滤镜。图A. 使用HaloTag® TMR配基对HEK293-p65-HT2细胞进行胞质(红色)标记。图B. 使用Anti-HaloTag® pAb进行胞质(绿色)标记。图C. 配基和抗体结合活性的共定位。图D. 红色和绿色荧光的叠加与DAPI对细胞核的复染(蓝色)。箭头表示很少或不表达HaloTag®-p65的罕见细胞。
更多资源：
小动物活体成像
NanoLuc® 报告基因用于表皮组织成像时可提供高灵敏度和低背景信号， 同时也已被成功用于深部组织成像事件。 这些报告基因不依赖ATP，因此允许在体内监测细胞内和细胞外事件。此外，使用基于 NanoLuc® 报告基因的 BRET 技术开发了多种体内成像策略。 该技术利用明亮的 NanoLuc® 信号来激发红移的荧光受体蛋白，从而创建增强型的深部组织成像解决方案。
活体小鼠的萤光素酶活性成像
NanoLuc® 报告基因非常适合作为蛋白标签用于 BLI 研究。 与其他发光报告基因蛋白（曝光时间可能需要几分钟）相比，极高的亮度意味着曝光时间可以减少到只有几秒钟。 此外，NanoLuc® 的小体积使其不太可能干扰融合伴侣的正常生物学特性或功能。 新型 Nano-Glo® Extended Live Cell Substrates 为长时间成像研究提供了选择。
View More 生物发光活体成像技术是应用萤光素酶作为报告基因标记细胞，并在小动物体内进行活体成像检测的一种技术。小动物活体成像能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。自NanoLuc®萤光素酶诞生以来，极大的拓宽了萤光素酶报告基因技术的应用范围，其高灵敏度和明亮的发光信号也为生物发光活体成像研究提供了更多可能。
以Firefly或Renilla为例，简述生物发光活体成像的操作流程：
活体动物成像可为在研究常规生理学、监测疾病进展或了解对治疗的反应时提供重要思路。 而NanoLuc® 报告技术为研究整个动物模型中的生物过程提供了新工具。 这些明亮而小巧的报告基因选项支持多种体内应用，从量化肿瘤生长变化到使用精心改造的NanoLuc®报告病毒使病毒复制和传播可视化。
NanoLuc®萤光素酶底物用于小动物活体成像：
Nano-Glo® In Vivo Substrate, fluorofurimazine (FFz) 是一种经过优化的试剂，专为 NanoLuc® 萤光素酶、NanoLuc® 融合蛋白或重组 NanoBiT® 萤光素酶的体内检测而设计。 这种水溶性试剂提高了体内检测时底物的生物利用率，同时产生明亮的信号，并且具有与体内工作流程相兼容的处理要求。 此外，该底物还能够特异性地用于 NanoLuc® 和萤火虫萤光素酶组成的双萤光素酶分子成像研究，为创建完整动物报告模型提供更多选择。
活体小鼠的萤光素酶活性成像
NanoLuc®萤光素酶底物用于活细胞内的生物发光成像：
Dr. Li-Fang Chu 实验室的研究人员首次使用生物发光活细胞成像观察了人类早期发育中振荡基因的时间。 点击Observing the human developmental clock with bioluminescence live-cell imaging了解更多。
NanoLuc®萤光素酶用于活细胞中的蛋白质动力学研究：
调控亚细胞定位是调节许多蛋白质功能和信号活性的重要机制。 例如，蛋白质从细胞质到细胞核的易位或蛋白质向质膜的募集都可能是信号通路激活的关键事件。 生物发光成像 (BLI) 可用于监测亚细胞蛋白定位，无需重复激发样品即可直接观察活细胞中的蛋白质动力学。
| 使用生物发光成像 (BLI) 监测 NanoLuc® 融合蛋白的易位。 使用PMA 处理并加入furimazine 底物后 20 分钟检测表达蛋白激酶 C (PKC)-NanoLuc 萤光素酶融合蛋白的 HEK293 细胞。 BLI 在 Olympus® LV200 生物发光成像仪上进行。 |
NanoLuc® 报告基因非常适合作为蛋白标签用于 BLI 研究。 与其他发光报告基因蛋白（曝光时间可能需要几分钟）相比，极高的亮度意味着曝光时间可以减少到只有几秒钟。 此外，NanoLuc® 的小体积使其不太可能干扰融合伴侣的正常生物学特性或功能。 新型 Nano-Glo® Extended Live Cell Substrates 为长时间成像研究提供了选择。
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