1、基本介绍
腺相关病毒（AAV）已经成为基因治疗中最有前景的病毒载体之一。重组AAV能有效地将遗传物质传递给分裂细胞和非分裂细胞。AAV具有复制缺陷、无致病性、无细胞毒性的特点，可以在细胞和组织中保持生理水平的表达。研发基于AAV的基因治疗面临着诸多挑战，包括缺乏简单且标准化的分析方法、制造可扩展性方面的困难以及大多数人群中存在AAV中和抗体。
为应对其中一些挑战，我们利用生物发光技术、蛋白质组学和基因组学工具，提供持续发展的新型AAV实验方案。
2. 双报告基因系统
2.1 NanoLuc®-HaloTag®Dual Reporter AAV System
 | 高灵敏且多用途的NanoLuc®-HaloTag®Dual Reporter AAV System可用于各种应用需求，包括新型血清型筛选、确定体内生物分布和中和抗体检测。 了解更多有关NanoLuc®萤光素酶和HaloTag®技术。 |
2.2 体外细胞转导检测（感染性）
| 利用针对不同AAV血清型的AAV-NanoLuc®-HaloTag®报告基因进行转导，可测量转导时不同AAV血清型对不同细胞系的选择性。如转导成功，表达的NanoLuc®萤光素酶将在有底物的情况下产生发光信号。由此产生的发光信号强度与AAV的转导效率成正比。 | NanoLuc®Luciferase Assay实验流程 NanoLuc®Luciferase Assay操作简单，能够快速、灵敏地检测AAV血清型的细胞嗜性。  |
2.3 数据展示
| 不同血清型的细胞嗜性发光检测 | |
 | AAV-NanoLuc®-HaloTag®报告基因对不同细胞系的选择性。使用分别对应AAV血清型1-10的AAV-NanoLuc®-HaloTag®报告基因检测不同组织类型的细胞系。对每种类型的细胞用对应各AAV血清型的报告基因以1000的MOI进行转导。加入底物后，测量表达NanoLuc®萤光素酶的感染细胞的发光信号。信号强度与AAV的转导效率成正比。 |
| AAV2-NanoLuc®-HaloTag®报告基因转导细胞的荧光成像 | |
| 加入Janelia Fluor®Halo Tag®646 Ligand | 与DNA染色（蓝色）叠加 |
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| 对AAV感染细胞进行荧光成像。用AAV2-NanoLuc®-HaloTag®报告基因转导U2OS细胞。转导48小时后，加入Janelia Fluor®HaloTag®646 Ligand与细胞共孵育。使用Keyence显微镜拍摄图像。表达HaloTag®蛋白的细胞为红色，DNA染色为蓝色。 | |
| 使用流式细胞仪测定AAV阳性细胞数 | |
 | 使用流式细胞仪对AAV阳性细胞进行量化。用AAV-NanoLuc®-HaloTag®报告基因（AAV1-AAV10）感染U2OS细胞，MOI为100000。转导48小时后，用Janelia Fluor®HaloTag®646 Ligand标记细胞，并使用流式细胞仪测量细胞数。 |
2.4 使用NanoLuc®萤光素酶检测体内嗜性和生物分布
| NanoLuc®萤光素酶和Nano-Glo®Fluorofurimazine In Vivo Substrate（FFz）为利用AAV进行体内生物分布研究提供了新的报告基因选择。Nano-Glo®FFz Substrate是一种水溶性检测试剂，专门针对NanoLuc®萤光素酶的体内检测进行了优化，其具有较高的底物生物利用率，可产生明亮、稳定的信号。Nano-Glo®FFz的处理要求与体内实验流程相兼容，提供灵活的传递选择，其底物的特异性使得NanoLuc®和萤火虫萤光素酶可以同时用于双萤光素酶成像研究。 |  |
- NanoLuc®AAV的组织嗜性（体内生物分布）数据
 | 注射了AAV9-NanoLuc®-HaloTag®病毒颗粒的小鼠体内全身成像。将浓度逐渐升高的AAV9-NanoLuc®-HaloTag®病毒颗粒注射入小鼠体内。转导7天和13天后，注射Nano-Glo®FFz（0.44μmoles），然后进行体内成像。转导7天后，组织嗜性开始出现；13天后，组织嗜性产生的信号更强，分布更广泛。生物发光成像在威斯康星大学的小动物成像和放射治疗机构完成。 |
2.5 分析AAV病毒基因组进行体内生物分布研究的实验流程
我们提供快速（约5小时）、高通量的DNA提取和定量实验方案，使您能够在不同组织中检测并定量AAV病毒基因组。
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- AAV在组织中的生物分布数据
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| 脑组织中AAV拷贝数的ddPCR结果。将不同浓度水平的AAV9-NanoLuc®-HaloTag®病毒颗粒注射入小鼠体内。注射14天后，收集组织并从中提取DNA。使用ITR和TERT（管家基因对照）引物和探针进行ddPCR扩增。 | 肝组织中AAV拷贝数的ddPCR结果。将不同浓度水平的AAV9-NanoLuc®-HaloTag®病毒颗粒注射入小鼠体内。注射14天后，收集组织并从中提取DNA。使用ITR和TERT（管家基因对照）引物和探针进行ddPCR扩增。 |
3. Lumit™Immunoassays
与传统ELISA相比，Lumit™Immunoassay技术作为更快速、更可靠的替代方案，消除了多个洗涤步骤引发的变异性，并提供了方便简单又灵敏的发光检测。
3.1 AAV衣壳滴度免疫测定法
与传统ELISA相比，Lumit™AAV Capsid Immunoassay可在更广的动态范围内对完整衣壳进行定量。该检测方法可用于纯化样品或处理中的粗裂解物。此简单的实验流程可在整个制造过程中实施，以优化转染及纯化和评估AAV产量。
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- AAV Capsid Lumit™Immunoassay实验流程
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- LumitTM Immunoassay测定AVV衣壳滴度数据
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| Lumit™Immunoassay对完整的AAV衣壳进行量化，动态范围达到3个数量级。使用两种完全不同的抗AAV9抗体对纯化的衣壳进行Lumit™Immunoassay实验，并将结果与市售的抗AAV9 ELISA检测进行比较。 | Lumit™Immunoassay对AAV衣壳测定具有广泛的线性范围。使用抗AAV2、抗AAV6和抗AAV8抗体对纯化的衣壳进行Lumit™Immunoassay实验。 |
4. AAV基因组滴度定量
| 在使用qPCR或dPCR测定AAV基因组滴度前，通常使用DNA酶处理样品。DNA酶处理时的消化不一致会导致qPCR或dPCR结果数据的改变。使用TruTiter™Reagent Kit，只有完整衣壳内的DNA会被扩增。这使得AAV病毒基因组的定量一致，并且不再需要DNA酶处理。 | 使用TruTiter™试剂，只有完整衣壳内的DNA可被扩增，实现准确的基因组滴度检测。 |
4.1 TruTiter™Reagent Kit使快速简单的检测实验流程成为可能
4.2 相比使用DNA酶的dPCR实验，使用TruTiter™Reagent的变异性更低
| TruTiterTM Reagent与DNA酶对比 | |
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| 腺相关病毒（AAV2-NanoLuc®构建）衣壳（1010GU/ml）在65℃下处理10分钟。热处理后，用DNA酶（红色）或TruTiter™Reagent（绿色）处理AAV构建体，使用dPCR扩增，并进行8次技术重复。 | 用0.1% Tween®-20处理腺相关病毒（AAV2-NanoLuc®构建）衣壳（1010GU/ml）10分钟。去污剂处理后，用DNA酶（红色）或TruTiter™Reagent（绿色）处理AAV构建体，使用dPCR扩增，并进行8次技术重复。 |
| TruTiterTMReagent对比DNA酶对比哺乳动物感染性检测 | |
 | 将AAV2-NanoLuc®病毒颗粒（107GU/ml）在指定温度下处理10分钟。温度处理后，用DNA酶（红色）或TruTiter™Reagent（绿色）处理AAV构建体，然后进行dPCR。同时，使用HEK293细胞进行24小时感染性检测（蓝色）。为了更好地解释说明，数据以室温（R.T.）处理下的信号的百分比表示。 |
5. 用于LC-MS分析AAV衣壳蛋白的肽图分析试剂
| 基于磁珠（SP3）的AAV衣壳蛋白样品新制备方法可以与我们的高质量蛋白酶组合一起使用。这种多蛋白酶衣壳图谱分析方案可以几近完整地覆盖整段序列。 SP3磁珠提供高效的污染清除，可以在非变性蛋白水解条件下使底物变性，并能浓缩稀释样品以进行LC-MS/MS分析。 对SP3磁珠的alpha测试感兴趣吗？联系我们。 |  |
5.1 使用SP3蛋白水解衣壳的实验流程
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| AAV衣壳蛋白肽段序列图谱分析 | |
| AAV衣壳蛋白肽段图谱序列覆盖。使用SP3磁珠处理衣壳蛋白。在低pH的AccuMAP™10X Low pH Reaction Buffer中，使用Trypsin Platinum、Arg-C Ultra、rAsp-N和糜蛋白酶进行蛋白水解。E/S比为1:25，蛋白水解在37℃下进行18小时。将肽段从SP3磁珠上分离并进行脱盐处理（C18），随后在接入Thermo NanoLC 1200 LC System的Thermo Scientific Orbitrap Exploris™240 Mass Spectrometer上进行LC-MS/MS。 |  |
5.2 用于LC-MS分析AAV衣壳蛋白的肽图分析试剂
| 试剂 | 主要用途 | 其他信息 |
| Trypsin Platinum | 衣壳蛋白序列图谱分析 | 具有极高特异性裂解和极高稳定性的重组胰蛋白酶 |
| Arg-C Ultra | 额外的衣壳蛋白覆盖 | 请联系咨询 |
| Chymotrypsin | 额外的衣壳蛋白覆盖 | 需要对胰蛋白酶未覆盖的衣壳酸性区进行图谱分析 |
| rAsp-N | 额外的衣壳蛋白覆盖 | 需要对胰蛋白酶未覆盖的衣壳蛋白区域进行图谱分析 |
| SP3 Sample Cleanup Kit | 蛋白捕获和消化的重要样品制备工具 | 与所有表面活性剂兼容，对稀释过的蛋白（病毒）进行有效富集。请联系咨询 |
| Rapid Trypsin/Lys-C | 脱酰胺位点图谱分析的有效工具 | |
| PNGase F | 对糖基化位点的图谱分析至关重要 | |
| AccuMAP™10X Low pH Reaction Buffer | 最小化衣壳蛋白脱氨反应 | 用于成功进行LC-MS/MS和肽图分析前的蛋白水解 |
6. AAV中和抗体（NAb）检测
中和抗体（抗AAV抗体）存在于接触过AAV的人类或动物血清中。基于NanoLuc®萤光素酶的NAb检测可测量因人血清中存在抗AAV抗体而导致的AAV转导抑制。这些抗体阻止病毒进入细胞，也阻止了NanoLuc®萤光素酶的表达。发光信号的减少表明人类血清中存在抗AAV抗体。
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| AAV中和抗体检测原理。发光信号的下降表明人血清中存在抗AAV抗体。 | 基于NanoLuc®萤光素酶的AAV中和抗体检测实验流程。通过发光信号测量AAV-NanoLuc®病毒颗粒的转导抑制，检测血清样品中的抗AAV抗体。 |
6.1 中和抗体滴度数据
| 测定人血清中NAb滴度 | |
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| 测定人血清样品中NAb的滴度。连续稀释血清样品以确定NAb滴度，NAb滴度为达到50%转导效率时的最低稀释因子。AAV-NanoLuc®病毒颗粒的转导效率是通过对NanoLuc®萤光素酶表达的发光检测来衡量的。 | 基于NanoLuc®萤光素酶的NAb检测的特异性。通过检测NanoLuc®萤光素酶表达，可以看出去除血清阳性样品中的抗体会恢复AAV-NanoLuc®病毒颗粒的转导效率。转导效率的恢复表明，基于NanoLuc®萤光素酶的NAb检测具有特异性。 |
