1. 基本介绍
慢病毒（lentivirus）是一种逆转录病毒，可以感染分裂细胞和非分裂细胞，这使其成为基因治疗应用中很受欢迎的载体。使用慢病毒载体，将治疗基因输送到病人的细胞中，来稳定地替换、修改或补充病人基因组中的缺陷或缺失基因。慢病毒载体也常用于在T细胞和其他免疫细胞中传递和表达嵌合抗原受体（CAR）。
本慢病毒载体产品提供一种新型的p24免疫测定法、T细胞重定向慢病毒过程中活性检测工具以及广泛的有关慢病毒表征与分析的基因组学实验方案。
2. Lumit™ p24 Immunoassay
| 在基因治疗流程中，对慢病毒衣壳上的p24蛋白进行有可重复性的检测是确定慢病毒滴度的一个基本步骤。利用Lumit™技术，我们已经开发出一种易于使用的免疫测定法，可快速检测p24蛋白。 Lumit™ p24 Immunoassay提供了一种简单、无需洗涤、动态范围广的实验方案，可在30分钟内完成，使其成为ELISA等传统费时费力的免疫测定的一个引人注目的替代方案。 | |
- LumitTM p24 Immunoassay检测数据
Lumit™ p24 Immunoassay具有宽广的线性动态范围（2~60000pg/ml），远超市面上已有的ELISA试剂盒的检测范围。
3. T细胞重定向慢病毒过程中活性检测
慢病毒载体常用于在T细胞和其他免疫细胞中传递和表达嵌合抗原受体（CAR）。
我们将已做适应调整的T Cell Activation Bioassay方案用于基于作用机制的Lenti-CAR病毒过程中活性检测。Lentivirus Bioassay具有高特异性、灵敏度和可重复性，并且仅需要极少的实验操作时间。该检测方法对稳定性具有指示能力，可轻松适用于不同的Lenti-CAR病毒，以便靶向不同的肿瘤抗原。
| CAR在有NFAT-萤光素酶报告蛋白的TCR/CD3效应细胞表面表达。当CAR与靶细胞上的抗原结合，发光信号会根据信号传导强度激发。 | TCR/CD3效应细胞在96孔板中与CAR慢病毒共同孵育。孵化24至48小时后，加入表达抗原的靶细胞。诱导6小时，加入Bio-Glo™Substrate，并测定发光信号。 |
3.1 Lentivirus Bioassay特异性数据
| Lentivirus Bioassay具有特异性 | |
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| 用系列稀释的CAR-19或GFP慢病毒转导TCR/CD3效应细胞。48小时后，加入Raji靶细胞（CD19+），诱导6小时后测定发光信号。只有用CAR-19慢病毒转导的TCR/CD3效应细胞对Raji靶细胞有反应。 | 用系列稀释的CAR-19慢病毒转导TCR/CD3效应细胞。48小时后，加入Raji靶细胞或CD19敲除的Raji靶细胞，诱导6小时后测定发光信号。对靶细胞的反应在敲除抗原后消失，证明了该检测的特异性。 |
3.2 Lentivirus Bioassay稳定性数据
Lentivirus Bioassay对稳定性具有指示能力
 |  通过在37℃下孵育2至48小时，制备CAR-19慢病毒的强制降解样品，然后通过TCR/CD3效应细胞和Raji靶细胞进行分析。该检测试验表明，慢病毒活性随着热处理时长增加而降低，表现为EC50升高和最大反应程度降低。 |
4. RNA或DNA自动化提取决定慢病毒载体表征
| Maxwell RSC®Instrument通过磁珠法，使用预填充盒和预定程序，可在25至60分钟内从各种类型的样品中提取DNA和/或RNA。 如果样本量较小，我们也提供高通量提取化学试剂和手动提取RNA和DNA的方案。 |  |
4.1 通过提取gDNA测定细胞转导后感染滴度的实验流程
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4.2 通过提取RNA测定制造的慢病毒载体批次拷贝数的实验流程
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4.3 数据展示
- gDNA提取测定感染滴度的检测数据
 | 从200万个用3个稀释度（1:5、1:10、1:20）的慢病毒载体转导的细胞以及未转导的细胞（无LV）中提取DNA。使用定制的Promega One4All试剂盒提取高质量gDNA，吸光度比高于2，且DNA质量和产量都符合分析要求。数据由Ixaka提供。 |
- RNA提取测定拷贝数的检测数据
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| 慢病毒拷贝数（平均值）与稀释因子相关性良好。高浓度样品（未稀释和1:10稀释的纯化病毒）表现出更高的变异性，可能是由于起始实验材料过多。在常规分析中，使用1:100稀释的纯化慢病毒进行RNA提取和病毒基因组滴定。每组条件下进行的RNA提取都做了重复组。数据由Ixaka提供。 | |
