万众期待的蛋白降解
自从蛋白降解子(degrons)被发现 (通常直接与泛素连接酶或蛋白酶体结合，使得蛋白质容易受到UPS介导的降解)，研究人员一直在寻找方法，来调节目标蛋白（POIs）稳定性。与基因技术相比，如CRISPR-Cas9或RNA干扰方法，靶向蛋白质降解（TPD）具有许多优点。
1. TPD通常会在数分钟到数小时内快速消耗目标蛋白，而不是操纵mRNAs或基因组DNA所需的几天或几周。这就阻止了分子补偿和细胞适应。
2. 基因操纵通常影响所有的蛋白质拷贝，针对蛋白质的方法直接允许某些蛋白突变体被选择性降解。
3. 蛋白质靶向方法是快速可逆，可控的。[1]
“白日梦”还是“救世主“-PROTAC
导致疾病的蛋白据估计仅有10%的蛋白能用小分子调控，10%能用生物大分子调控的蛋白在细胞表面，而高达80%的蛋白由于缺少活性位点等原因无法用现有药物调控。在过去的二十年里，蛋白降解研究领域的里程碑事件就是2001年蛋白降解靶向嵌合体技术-PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）的诞生。
> PROTAC的作用过程 <
嵌合体分子包括三部分，形象地被称为哑铃状结构：一头是靶向目标蛋白的结构；另一头是可以招募蛋白降解体系比如E3连接酶的结构；中间通过合适的linker连接，形成双功能小分子。
从白日梦到目前小分子新药公认的重要前沿，PROTAC为不能成药的靶蛋白带来了"福音"，因其可以把本来不需要降解的目标蛋白降解。其优点如下
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靶向降解“不可成药靶点”
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克服肿瘤耐药性；
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延长作用时间：
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对蛋白的酶活功能和非酶活功能均可调控。
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虽然PROTAC承载了众多药研人的期望，但其研发过程仍有许多待解决的难题！如分子量通常较大、分子刚性、水溶性都不甚理想，所以口服吸收和过膜性都会较差，待验证的脱靶毒性等。
研发进展
2020年7月10日，赛诺菲以1.5亿美元首付、20亿潜在里程金、加销售提成与美国生物技术公司Kymera 达成合作意向、进入蛋白降解领域。
而PROTAC制药领域先驱Arvinas公司开发的全球首个PROTAC药物, ARV-110，拟用于治疗去势抵抗性前列腺癌，也已经进入临床I期研究阶段，临床I期的初始数据表明ARV-110具有良好的口服利用度和良好的安全性和耐受性。而国内外多家制药巨头也早已注资布局PROTAC领域。而随着该领域的研发进展，Promega作为PROTAC研究方法的资深供应商也走入了大众视野。2020年7月发表在Nature Structural & Molecular Biology上的一篇综述详细介绍了蛋白降解小分子化合物的研发进展，同时介绍了应用于这个领域研发的相关技术，而Promega的多项技术榜上有名。
图片来自Promega
PROTACs研发加速器
PROTAC研究过程中一步的行差步错，就可能导致多年的研发努力前功尽弃。因此一个成功的PROTAC的诞生需要可靠的研究方法为其保驾护航。
Promega的完整PROTAC功能验证方案，为您回答研发中的关键性问题，加速您的PROTAC分子研发进程：
1. PROTACs是否能够透过细胞膜? 与靶蛋白的亲和力如何?
在开发降解化合物时，评估它们的细胞通透性和对靶蛋白和E3连接酶的亲和力是一个关键环节。NanoBRET™ Target Engagement（TE）分析能够检测活细胞中蛋白质与小分子的结合相互作用，定量检测靶蛋白与化合物亲和力和占有率。
原理：
NanoBRET™ TE检测系统也是一种BRET检测法，利用NanoLuc®萤光素酶标记靶蛋白，细胞渗透性荧光NanoBRET Tracer进行检测。当Tracer可逆地与细胞中的靶蛋白-NanoLuc®融合蛋白结合时，NanoLuc®标记的靶蛋白产生的发光能量转移到细胞渗透性荧光Tracer而产生BRET信号。化合物与Tracer竞争结合靶蛋白会导致BRET信号的减弱，从而用于检测化合物与细胞的亲和力。目前Promega已经开发了CRBN、VHL、XIAP、cIAP和MDM2的TE检测方法。NanoBRET™ TE E3连接酶检测可以在活细胞或透性化细胞中评估E3连接酶的化合物亲和力以及化合物的渗透性。
2. PROTAC是否与靶蛋白与E3连接酶形成了三聚体复合物?
E3三聚体复合物的形成（包括靶蛋白、降解化合物和E3连接酶）可能是靶向蛋白降解过程中最关键的一步。这一步是开发和优化有效降解化合物的关键参数。而NanoBRET™ Assay技术非常适合于在活细胞条件下研究三聚体复合物的形成，可以进行终点分析或动力学分析。
原理：
靶蛋白作为能量供体（生物发光），在细胞中外源性瞬时表达NanoLuc®-POI融合蛋白或在表达有LgBiT的细胞与HiBiT蛋白标签内源性融合表达。HaloTag®与VHL或CRBN E3连接酶组分外源性融合表达，并用荧光配体标记作为能量受体。当三聚体有效的形成时，即产生BRET信号。
3. 靶蛋白是否被泛素化?
NanoBRET™ 能量共振转移技术可用于检测靶蛋白泛素化的动力学，或以终点检测形式用于化合物剂量-反应曲线检测等应用。
原理：
NanoBRET™ 泛素化检测中，靶蛋白作为能量供体，在细胞中外源性瞬时表达NanoLuc®-POI融合蛋白表达或在表达有LgBiT细胞中与HiBiT蛋白标签内源性融合表达。HaloTag-Ub融合蛋白是外源性表达的能量受体, NanoBRET™ 信号可以使用终点法或实时动力学进行分析。与三聚体复合物的形成类似，泛素化的变化通常在化合物处理后的1-4小时内观察到。
4.靶蛋白是否被转运到蛋白酶体?
在这个环节的研究中同样是应用了NanoBRET™技术。具体流程见下方示意图。
原理：请点击放大
5.靶蛋白是否被成功降解?
HiBiT技术使蛋白质降解功能的定量分析成为可能。HiBiT是一种11个氨基酸的肽标签，对其互补LgBiT蛋白有很高的亲和力。二者结合可构成具有完整酶活性的NanoBiT®萤光素酶。当使用CRISPR基因编辑将HiBiT引入内源性位点时，可通过NanoBiT® PPI原理产生与内源性靶蛋白水平相关的非常明亮和高度敏感的发光信号。
加入引起降解的化合物会导致发光信号的丢失，可以在24-48小时的时间内实时监测细胞的剂量反应曲线，从而可以准确测定降解率、Dmax、DC50值和蛋白质回收率。这种方法可以根据一系列不同的参数对降解进行快速排序，适用于高通量筛选。
6. 蛋白降解后的细胞表型变化
细胞内蛋白质的暂时降解通常会引起与基因敲除或蛋白质突变截然不同的表型。HaloPROTAC-3融合了HaloTag®标签和PROTAC，是一种快速、高效地了解和描述蛋白质降解表型的方法。
原理：
HaloPROTAC-3募集内源性VHL E3连接酶组分到HaloTag®融合蛋白，引起泛素化并通过蛋白酶体途径降解该蛋白。HaloPROTAC含有降解诱导性酰胺基团，通过可变长度的linker与氯代烷烃基团偶联。
研究相关细胞背景下的内源性蛋白丢失，我们建议通过CRISPR/Cas9基因编辑将HaloTag®或HiBiT-HaloTag®标签整合到目标蛋白位点。使用HaloTag®单克隆抗体（针对HaloTag®标签）或活细胞发光检测法（使用HiBiT HaloTag®标签）对HaloPROTAC-3处理的细胞中的蛋白质降解进行监测。HaloPROTAC-3显示了随着时间的推移，内源性标记HaloTag®的融合蛋白的快速爆发性丢失。
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(图片来自Promega)
参考文献：
Wu, T., Yoon, H., Xiong, Y. et al. Targeted protein degradation as a powerful research tool in basic biology and drug target discovery. Nat Struct Mol Biol 27, 605–614 (2020).
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