CRISPR / Cas9 HiBiT敲入：研究内源性蛋白质动力学的可扩展型方法

最新一期的《Scientific Reports》以Promega研发科学家们的最新研究为特辑（详见文末更多资源）。该研究以前期论文为基础，对几种不同的细胞系中更为全面、更为多样的蛋白进行了HiBiT报告基因标签的CRISPR/Cas9敲入实验。研究人员选择了大小、亚细胞定位、生理功能以及转录表达水平各不相同的97个靶点（在四个细胞系中），研究中所有标记蛋白的向导RNA和供体DNA序列详见文末更多资源。

研究结果表明其中83个靶点可被HiBiT标记并通过发光信号进行检测。使用蛋白印迹分析研究这些靶点共计需要97种抗体，因此成本更高且更为耗时。而且，如果针对特定靶点的抗体并不存在，那么则很可能无法进行实验。研究发现表明，这种方法可广泛用于分析内源性蛋白且可进行扩展。

生物发光成像技术用于验证编辑的HeLa混合细胞中HiBiT融合蛋白的亚细胞定位

除此之外，这份报告还提供了有关敲入细胞验证和表征的更多详细信息。筛选用于发光信号检测的编辑的混合细胞后，还进行了额外的验证以确认HiBiT标记蛋白的表达、大小和位置。使用了HiBiT特异性印迹分析和生物发光成像技术代替了蛋白印迹分析和免疫荧光显微技术。HiBiT的灵敏度很高，因此它可实现发光板检测、印迹分析和生物发光成像等应用场景中的多种形式的定量分析。

该文章旨在更深入地了解通过内源性蛋白标签而开发出的细胞模型的性能。通过比较从内源性基因座表达的HiBiT融合蛋白和通过两个转录调节蛋白的质粒表达的HiBiT融合蛋白的数据，研究人员证明了编辑过的细胞较之于传统的过度表达模型的优势。只有内源性表达才能提供准确反映细胞蛋白动力学的数据。保持细胞完整性可实现在自然状态下对信号通路的分析，同时不会产生与过度表达相关的假象，而且经过编辑的细胞更能准确地反映靶点的生物学特征。