一种用于探究细胞信号通路调控的通用型生物发光免疫检测方法
信号通路的激活会直接影响多种细胞应答反应（酶活性，基因表达，蛋白易位或降解），而信号通路中由特异性激酶构成的重要结点也会引起特异性磷酸化事件，信号通路的中断还会导致如肿瘤和炎症性等疾病。因此，监测细胞信号事件有助于更好地理解健康和疾病中的细胞行径。
传统的免疫学检测方法，例如ELISA或Western blot，在研究细胞信号时步骤繁琐，且很难兼容高通量检测（HTS）。
Promega的Lumit™免疫检测细胞系统
● 一种新的基于细胞的检测方法，将免疫检测与生物发光酶的亚基互补技术完美结合；
● 基于溶液的检测方法，无需洗涤，无需转移，无需固定；
● 可在同一样本孔中裂解细胞，结合抗体，检测发光信号；
● 采用均质型的“加样-读数”模式，仅需不到2小时就可以完成整个操作流程；
● 通过特异性磷酸化结点，可在未经修饰的细胞中监测多个信号通路的激活和失活。
研究结果表明，该种技术可广泛应用于感兴趣的信号通路的研究或者用于鉴定信号通路中特定化学或生物学抑制剂。
癌症或炎性应答相关的信号通路
Lumit™免疫检测细胞系统的原理
生物发光型的Lumit™免疫检测是基于NanoLuc Binary Technology（NanoBiT®）二亚基系统（SmBiT:11氨基酸肽，LgBiT:18kDa）。该系统中，NanoBiT® 亚基分别与anti-mouse和anti-rabbit二抗（Lumit™二抗）融合。
Lumit™免疫检测细胞系统的原理。细胞经过刺激处理，激活信号通路，之后磷酸化的或总的靶蛋白在裂解的细胞中被各自对应的一抗抗体对识别。然后Lumit™二抗识别他们同源的一抗，最后导致NanoBiT® 的两个亚基相互靠近，形成有功能的酶，产生明亮的发光信号。
Lumit™免疫检测细胞系统应用
案例及数据展示
开发用于检测IkBα磷酸化或降解的Lumit™免疫检测
● 筛选和优化用于Lumit™免疫检测的一抗抗体对是简单且快速的。
● 在NF-kB信号通路激活情况下检测IkBα蛋白及其磷酸化蛋白，生物发光信号与细胞数增长呈线性关系。
● 在低细胞密度时检测总蛋白和磷酸化蛋白也能得到较好的灵敏度。
对Lumit™免疫检测细胞系统检测总IkBα和磷酸化IkBα进行验证
Western blot 实验流程（异质型）
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激活信号通路 |
裂解细胞 |
加入Loading buffer并煮沸 |
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SDS-PAGE分离蛋白 |
转移蛋白至膜上 |
封闭 |
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洗涤 |
加入一抗并孵育 |
洗涤 |
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加入二抗并孵育 |
洗涤 |
加入检测试剂 |
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读取信号 |
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Lumit™免疫检测实验流程（均质型）
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激活通路 |
将裂解缓冲液加入细胞中(20分钟) |
加入抗体溶液(90分钟) |
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加入检测试剂 |
检测发光信号 |
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比较Lumit™和Western blot在检测总IkBα和磷酸化IkBα时的区别
● 在产生相似的数据结果下，均质型的Lumit™免疫检测细胞系统要比传统的Western检测更简单更快速。
● IkBα的磷酸化和降解可通过Lumit™免疫检测在细胞数较少的情况下进行定量检测。
通过检测总IkBα和磷酸化IkBα揭示NF-kB信号通路的激活机制
TNF处理后检测总IkBα和磷酸化IkBα
a.揭示了TNF处理后NF-kB信号通路预期的生物学特性：IkBα磷酸化（pS32）后开始快速降解；无需对细胞进行改造，因此也可在原代细胞中获得相同的检测结果（d和e）。
b.揭示了蛋白酶体抑制剂MG132处理后NF-kB信号通路的应答机制：蛋白酶体抑制剂存在时会阻滞IkBα的降解并使p- IkBα累积。
c.CHX抑制新生的IkBα蛋白表达以应对长期的NF-kB信号通路激活，并且Lumit™免疫检测能够很容易完成该项检测。
多种信号靶标蛋白的检测
在信号通路激活和失活条件下检测总的和磷酸化的靶标蛋白
● 揭示了在配基介导的激活作用下多种信号通路预期的生物学特性：例如IkBα(S32),STAT3(Y705)等信号通路结点的快速磷酸化或者是Wnt处理后一个靶蛋白结点如β-Catenin的降解。
● 检测在结点性激酶或通路抑制剂处理后信号通路预期的应答机制：例如IKK复合物，PI3K，JAK2抑制剂分别抑制IkBα/P65、AKT和STAT3的磷酸化。
信号通路节点激酶用小分子抑制后的检测
Lumit™免疫检测细胞系统在高通量筛选中的应用
● 生物发光法的Lumit™信号通路检测揭示了信号通路结点激酶抑制剂的预期药理学特性
● Lumit™免疫检测以快速、均质型的方式被应用在肿瘤抑制物的筛选，免疫和炎性应答信号通路研究中
● 高的Z’值表明Lumit™免疫检测细胞系统在高通量筛选中具有良好的适用性
利用Lumit™免疫检测研究小分子和大分子的信号通路调控
化学和生物学类抑制剂对JAK/STAT信号通路的抑制机制
使用p-AKT检测分析c-MET小分子和大分子抑制剂对c-MET信号通路的抑制机制
● 生物发光法的Lumit™免疫检测可用来鉴定信号通路中的小分子和大分子抑制剂
● 信号通路结点的磷酸化可在受体水平上作为生物大分子药物活性的报告基因
● 针对p-AKT结点的Lumit™免疫检测可以快速简单的方式被用于非工程改造的细胞中筛选抗c-MET大分子药物
总结
生物发光法的Lumit™免疫检测细胞系统优势：
● 生物发光法，不易受化合物干扰
● 均质型检测，“加样-读数”模式
● 无需对细胞进行改造，检测内源性底物的磷酸化
● 无需特殊的仪器，对检测板无特殊要求。仅需一台发光检测仪
● 低复杂度，与Western，ELISA，或基于荧光的技术相比，操作步骤少，检测更迅速
● 适用HTS形式
● 建立自己的检测模式，Lumit™检测抗体适用于研究任何感兴趣的信号通路
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