文献分析
Literature Analysis
结直肠癌患者中循环游离DNA微卫星不稳定性（MSI）的检测 Topic
近年来，由于液体活检所具有的取样优势，通过液体活检方式进行肿瘤标志物检测的方面的研究也在不断深入。这些探索进展或将为临床诊断和疾病治疗带来更多机会。
MSI作为重要的林奇综合征和结直肠癌肿瘤标志物，其此方面的研究也不断推陈出新。
今天就为大家分享来自南加利福尼亚大学洛杉矶分校病理学系和Norris综合癌症中心对于结直肠癌患者中循环游离DNA微卫星不稳定性（MSI）的检测可行性的研究数据：
01
前 言
以程序性细胞死亡蛋白-1(PD1)、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)为靶点的检查点抑制剂可成功地治疗出现微卫星不稳定性(MSI)的结直肠癌患者，因此迫切需要新技术作为治疗反应监测手段来评估MSI的进展情况。由于治疗期间通常无法获得连续的肿瘤标本，使得情况更为复杂，因此我们认为液体活检可以作为接受治疗的患者重要的肿瘤DNA来源（通过微创方法极易获取）。
02
研 究 方 法
从10例与高微卫星不稳定性（MSI-H）相关的IV期结直肠癌（CRC）患者处采集的血样（置于Streck DNA管）中分离循环游离DNA（ccfDNA）。对8例患者进行连续采样。此外，从3例肿瘤未呈现不稳定性（微卫星稳定（MSS））的IV期CRC对照患者处采集血样。采用Promega公司提供的试剂盒分离ccfDNA并进行MSI监测。通过比较基因组DNA与ccfDNA中每种生物标志物的电泳图谱对微卫星改变进行评分。如果此方法可行，则另将电泳图谱与相应原发性肿瘤的电泳图谱进行比较。使用Sentosa平台的Vela 11基因靶向NGS CRC试剂盒筛选4例已知出现原发性肿瘤驱动突变患者的ccfDNA是否存在这些突变，并由Sentosa的报告者进行分析。使用高灵敏度和基因组DNA Tapescreens（Agilent）检测ccfDNA样本的浓度和质量。
03
结果与讨论
10例MSI-H患者中（表1）的6例，在首次液体活检采样中显示出MSI-H，其中3例为基线采样。
表1
原发性肿瘤中MSI状态与ccfDNA之间的相关性以及与每例患者的免疫治疗应答之间的相关性。NED*无疾病证据
在所有6例病例中，ccfDNA中的受试生物标志物电泳图谱与相应原发性肿瘤中的电泳图谱匹配（图1）。
图1
4号病例ccfDNA（上图）中5个微卫星生物标志物与匹配的原发性肿瘤（下图）电泳图谱的比较。上图为来源于液体活检样本(ccfDNA,红色标记)，以及来源于棕黄层(白细胞DNA,绿色标记)的叠加图谱。下图为来源于肿瘤组织(原发病灶，红色标记)图谱、来源于ccfDNA样本(绿色标记)图谱，以及来源于棕黄层(白细胞DNA，黑色标记)的叠加图谱。
7例（病例2-8）对免疫治疗有应答的病例进行了连续液体活检采样；1例无疾病证据的患者因DNA不足而未进行检测，其余6例在最终液体活检中均显示MSS（表1）。病例9最初对免疫治疗有应答，在第一次液体活检结果与MSS相吻合，但其疾病出现复发，且下一次液体活检显示出MSI。尽管治疗期间的液体活检显示微卫星特征正常，但是病例10对免疫治疗无应答。虽然肿瘤样本实际经过激光捕获显微切割（以确保正常细胞的污染最小）且从患者的液体活检中回收了大量的ccfDNA（图2b），但是指示微卫星不稳定性的变异等位基因在原发性肿瘤中的丰度较低（图2a）。
图2
（a）经过激光捕获显微切割后（确保正常细胞的污染最小），从10号病例的肿瘤样本内提取的基因组DNA MSI BAT-26的电泳图谱（红线）。从同一患者正常细胞中提取的基因组DNA图谱如叠加的蓝线所示。只有小部分源于原发肿瘤的PCR产物出现大小异常，提示存在微卫星不稳定性，该情况在液体活检中未检出。（b）10号病例的液体活检中回收的DNA的生物分析仪图片证实存在大量的ccfDNA（星号）。
微卫星稳定的原发性肿瘤患者液体活检均未见MSI。病例4连续两次MSI-H液体活检阳性，第二次活检显示治疗4周内肿瘤特异性等位基因相对于生殖系等位基因的丰度有所下降（图3）。最后3次活检未检出MSI。病例5连续2次呈现MSI-H活检阳性，但第3次活检显示MSS。
图3
原与4号病例相隔4周的两个连续时间点，ccfDNA与匹配的血沉棕黄层基因组DNA中NR-24等位基因的相对强度。红线显示ccfDNA结果，而叠加的绿线显示同一患者血沉棕黄层的结果。第8周第三次活检时，未检出MSI特征。
在原发性肿瘤中发现驱动突变的情况下，通过NGS检查匹配的ccfDNA样本中突变的一致性（表2）。
表2
存在可追踪突变患者的ccfDNA中MSI和驱动突变状态与免疫治疗应答的相关性。括号中的数字表示等位基因频率，而其他数字表示覆盖深度。
2例对免疫治疗有应答的患者中，原发肿瘤中存在的KRAS突变与ccfDNA中的突变一致（例3和4）。患者10对免疫治疗无应答，但其ccfDNA水平高（图2），基线液体活检检出KRAS G12D突变，等位基因频率为21%。1例MSS对照组患者的ccfDNA中检出KRAS G12C突变，等位基因频率为44%。
05
研究结论
10例原发性肿瘤中均有MSI-H记录的患者中，9例患者的临床治疗应答和液体活检样本中微卫星不稳定性检测能力之间具有极佳的一致性。对免疫治疗无应答的患者的液体活检中，未检出异常微卫星等位基因，这与对治疗有轻微亚临床应答相一致，基因组不稳定升高的肿瘤细胞群体中可能更容易出现轻微亚临床应答。研究结果显示可以在结直肠癌患者的液体活检中检出微卫星不稳定性。循环无细胞DNA源自接受治疗的患者的肿瘤基因组DNA（通过微创手术极易获取）。PCR检测ccfDNA MSI的相对灵敏度似乎至少与NGS方法检测驱动突变的灵敏度相当。
06
可用产品
01
产 品 优 势
Promega 的 MSI 技术是全球领先的金标准 MSI 检测技术，也是全球第一个商品化的 MSI 检测系统。Promega MSI 技术已经 在临床研究中广泛使用了 15 年以上，并被 140 多篇学术论文引用。比 NGS 相比 , Promega MSI 技术更简单 , 成本更低，速度 更快，是可负担的标准化方法，与 IHC-MMR 检测相结合，可将灵敏度和特异性提高到近 100%。2021 年，Promega 的 MSI Analysis System 先后获得 CE-IVD 认证，美国 FDA 认证。同时，Promega 的 MSI检测产品目前正在中国进行国家药品监督管理局（NMPA）创新医疗器械特别审批认定的审核，即将作为体外诊断试剂（IVD） 上市。Promega 的 MSI 检测产品采用了 5 个单态单核苷酸重复微卫星位点设计，这也是美国国家癌症研究所 (NCI) 认可的设计。我 们采用了一组对检测 MSI 状态更敏感而特异的位点，从而得到更精准的结果，进而帮助医生对癌症患者评估出最佳治疗选择， 包括辅助诊断那些有望受益于免疫抑制剂治疗的患者。
Promega可提供从样本制备到MSI检测的完整解决方案。
Promega已与默沙东，Incyte及Henlius公司达成战略合作，MSI检测系统将作为其药物的伴随诊断试剂用于临床指导用药。
02
产 品 信 息
产品介绍请点击下表中产品名称
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血液ccfDNA的MSI检测 可用解决方案 (Research Use Only) |
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流程 |
产品 |
目录号 |
规格 |
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ccfDNA提取 试剂 |
Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit |
AS1480 |
48preps |
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核酸提取仪 |
Maxwell® RSC System |
AS4500 |
1台 (1-16样本通量) |
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Maxwell® RSC 48 Instrument |
AS8500 |
1台 (1-48样本通量) |
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MSI检测 |
MSI Analysis System |
MD1641 |
100 rxns |
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