生物发光法与传统油红O染色评估脂肪生成性能比较
研究脂肪生成过程，即干细胞分化为成熟脂肪细胞（脂肪细胞）的机制，对于了解糖尿病、肥胖症、心血管疾病、肝病和癌症等疾病的发病机制和寻找潜在治疗方法至关重要。检测脂肪细胞祖细胞在培养物中的脂肪生成能力（例如，受到某些生长条件或化合物的影响）是此类研究的一个基本方向，因此也是该领域研究人员的主要目标。
传统研究方法一般采用基于吸光度检测来评估脂肪生成能力，该检测涉及脂溶性染料，比如油红O。然而，这种检测方法与较新的检测方法相比，存在一些局限性，例如，灵敏度低、定量范围较窄和手动操作时间较长。
本实验通过检测完全分化（成熟脂肪细胞）、部分分化和未分化的3T3L1-MBX成纤维细胞，比较了Triglyceride-Glo™ Assay(生物发光法)与Cayman Chemical Adipogenesis Assay（油红O染色）的定量范围和可用性。
脂溶性油红O染料检测吸光度
非直接定量
操作时间长
直观观察染色
Cayman Chemical Adipogenesis Assay利用脂溶性油红O染料检测样品的脂质含量（主要是甘油三酯）。细胞经染色和洗涤之后，提取出脂质结合染料，然后转移至检测板中测定吸光度。因此，吸光度与样品的脂质含量成正比，并可用于评估脂肪生成；然而，这种方法不能直接进行脂质定量。
主要优势：
油红O通过染色直观地识别细胞分化程度
不同分化阶段的3T3L1-MBX细胞的图像
（放大20倍）
上图. 未分化（左图，实验第20天接种）、部分分化（中图，实验第10天接种）和完全分化（右图，实验第1天接种）3T3L1-MBX成纤维细胞的图像（在实验的第22天拍摄）。使用Triglyceride-Glo™ Assay和Cayman Chemical脂肪生成检测试剂盒检测每个生长阶段的细胞脂肪生成的程度。
使用油红O脂溶性染料染色不同分化阶段的3T3L1-MBX细胞的图像（放大 20 倍）
上图. 使用油红O脂溶性染料染色不同分化阶段的3T3L1-MBX细胞的图像（放大 20 倍）。在实验的第22天，使用Cayman Chemical Adipogenesis Assay对3T3L1- MBX成纤维细胞进行固定和染色。未分化（左图，实验第20天接种）、部分分化（中图，实验第10天接种）和完全分化（右图，实验第1天接种）的3T3L1-MBX成纤维细胞的图像。脂质（按重量计约占成熟脂肪细胞的95%以上）结合染料并呈现红色。
主要劣势：
操作时间长，灵敏度低、无法直接定量脂质
1、Adipogenesis Assay需要添加更多的试剂到细胞中，并且还需洗涤至少6次，所以移液操作更多；
2、操作耗时，需要使用许多的移液器吸头，增加了将细胞从孔板底吸出或刮掉的可能性；
3、油红O染色剂在孔的侧面干掉并且洗涤无法去除。这可能会导致测量不准确；
4、根据Adipogenesis Assay标准步骤检测，含有完全分化细胞的孔的吸光度读数范围通常为0.2至0.4，而含有未分化细胞的孔的读数通常在0.05左右。使用该试剂盒可获得的最大S/B比约为8，远低于生物发光法。
发光法甘油三酯检测试剂盒
直接定量
操作简单
信背比高
Triglyceride-Glo™ Assay的发光信号与样品中的甘油量成正比。游离甘油可以通过直接裂解细胞不添加脂肪酶进行定量，总甘油可以通过裂解细胞并添加脂肪酶（将甘油从甘油三酯中释放）来进行定量。然后将检测试剂添加到细胞裂解物中，甘油通过酶偶联化学反应发光。采用甘油标准曲线，将发光信号转换为甘油浓度值，根据游离甘油浓度和总甘油浓度之间的差值，计算甘油三酯的浓度（按重量计约占成熟脂肪细胞的95% ），并评估脂肪生成。
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主要优势一：定量检测甘油三酯含量
上图.Triglyceride-Glo™ Assay标准曲线。为了确定细胞裂解物的冻融对测定的影响，将细胞裂解物（使用甘油裂解液裂解）在-20℃下冷冻5天。
两种方法评估脂肪生成程度比较
较高的值表示更完整的脂肪生成。两种检测的结果趋势相似，与部分分化细胞和未分化细胞相比，完全分化细胞的结果值更高。虽然这两种分析都是根据甘油三酯的含量来评估脂肪生成，但Triglyceride-Glo™ Assay通过直接测量甘油和甘油三酯浓度定量分析脂质含量，而Adipogenesis Assay只能定性分析细胞的脂质含量。
定量分析vs定性分析
上图.使用两种检测分别检测完全分化（成熟脂肪细胞）、部分分化和未分化3T3L1-MBX成纤维细胞。A. Triglyceride-Glo™ Assay所得甘油三酯浓度±标准偏差（n=9）。根据甘油标准曲线计算并校正稀释度，将按1:25 稀释的总甘油裂解物所得RLU转换为浓度值。由于游离甘油的浓度可以忽略不计，实际上可以认为[总甘油浓度]=[甘油三酯浓度]。B. 脂肪生成检测所得的平均吸光度±标准偏差（n=9）。
主要优势二：高灵敏度和信背（S/B）比
将总甘油细胞裂解物稀释至测定线性范围内后（甘油浓度<80µM），测定成熟脂肪细胞，Triglyceride-Glo™ Assay得出的最大S/B比约为50，Adipogenesis Assay的最大S/B比约为5。Triglyceride-Glo™ Assay约为Adipogenesis Assay的10倍。
上图.通过Triglyceride-Glo™ Assay和Cayman Chemical Adipogenesis Assay得出的S/B比。使用两种检测分别检测完全分化（成熟脂肪细胞）、部分分化和未分化3T3L1-MBX成纤维细胞。对于Triglyceride-Glo™ Assay，在进行发光测量之前以 1:25的比例稀释细胞裂解物，确保甘油浓度在标准曲线的线性范围内（甘油浓度<80µM）。显示每个检测的平均S/B比±误差（n=9）
主要优势三：操作简单、无需有机萃取
Triglyceride-Glo™ Assay的一般步骤：
洗涤细胞两次，添加裂解液，按需要稀释细胞裂解物，然后添加检测溶液，操作时间更少。基于去污剂的样本制备方法，无需有机萃取。
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电话：010-58256268
公司网址：www.promega.com.cn
技术支持邮箱：chinatechserv@promega.com
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