Promega萤光素酶技术有声故事
Podcasts for Luciferase Technologies
2022
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冠状病毒研究中萤光素酶标记的报告基因假病毒颗粒的测量选择
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麦主播：白小白 |
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大家好，我是麦主播白小白。清澈温柔的女生声线，有点萌更有点甜，希望大家会喜欢我的声音，更喜欢我带来的故事！ |
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Story Introduction
故事内容简介
背景介绍
萤火虫萤光素酶的测量
海肾萤光素酶的测量
NanoLuc®萤光素酶
资源列表
目前，冠状病毒（CoV）研究人员正致力于研究SARS-CoV-2进入细胞的方式。冠状病毒表面存在的刺突或S蛋白为三聚体。单体由S1和S2结构域组成。在产生病毒的细胞中，S1和S2结构域于弗林蛋白酶切位点分离。三聚体与细胞表面蛋白结合。就SARS-CoV而言，受体为血管紧张素转换酶2（ACE2）。MERS-CoV利用细胞表面存在的二肽基肽酶IV蛋白。SARS-CoV-2也利用ACE2。内化的S蛋白在S1/S2酶切位点附近被称作S2′的位置被宿主细胞蛋白酶二次酶切，从而导致其构造发生显著变化（可能促进膜融合和病毒进入细胞）（1）。
CDC/Alissa Eckert，MSMS；Dan Higgins，MAMS
研究人员并未直接使用病毒开展研究工作，他们选择构建假病毒颗粒。假病毒颗粒中含已知亲代病毒（例如水疱性口炎病毒）包膜蛋白，并用研究用病毒宿主细胞结合蛋白（S蛋白）替代天然宿主细胞结合蛋白（例如糖蛋白G）。假病毒颗粒一般携带报告基因质粒（萤火虫萤光素酶（FLuc）最为常见），病毒颗粒中包含必要遗传因子。
构建假病毒颗粒时，需将质粒或仅RNA转染至细胞中，假病毒会经由内质网和高尔基体从细胞释放至培养基中。假病毒（含目标病毒蛋白）用于研究病毒进入细胞的过程。通过对报告基因进行检测，从而监测病毒进入细胞的过程。报告基因可为萤光素酶或荧光蛋白。
假病毒已被用于研究由SARS-CoV-2 S蛋白和其他冠状病毒S蛋白介导的病毒进入宿主细胞的过程。Walls等人（1）选择使用ONE-Glo™ EX Luciferase Assay System对萤火虫萤光素酶（FLuc）报告基因进行检测。Letko、Marzi和 Munster（2）则选择了Bright-Glo™ Luciferase Assay System。Ou等人（3）选择了Steady-Glo® Luciferase Assay System，Xia 等人（4）则选择了原始Luciferase Assay System。虽然这些检测系统性能均较好，但其用途确存在一定差异。
Xia等人选择的原始Luciferase Assay System为第一代萤光素酶检测系统。该检测系统涉及细胞洗涤，而且还需使用Cell Culture Lysis Reagent或Reporter Lysis Buffer制备裂解物。取部分裂解物与萤光素酶检测试剂混合，然后使用单管光度计（例如GloMax® 20/20仪器）测量发光信号。该系统的光输出信号极为明亮，但其半衰期<10分钟。如果您使用单管光度计进行单次检测，则不是问题。如果使用96孔板进行检测，则需使用配备了进样器的微孔板读数检测仪（。依次进样所有孔位并测量。测量一块微孔板所需的检测时间达1小时。
第二代检测系统，“Glo”检测系统，适用于检测多孔板。这些试剂可裂解细胞，且试剂中还含有萤火虫萤光素酶测量用底物。整个孔板中均应添加试剂，然后依次快速读取孔板上所有孔的信号。如果使用GloMax® Discover等仪器，则仅需约1分钟便可读取整个96孔板。
Steady-Glo®检测系统适用于超高通量场景（按批处理孔板）。与第一代检测系统相比，其发光信号较弱，但发光信号可持续数小时，而不仅仅是<10分钟。将试剂依次加至10~100块孔板中，然后将其转移至光度计中并依次读取。Bright-Glo™检测系统可产生明亮的光信号，这与第一代检测系统类似，但是该系统还具备其他优势，即信号半衰期≥25分钟。Bright-Glo™检测系统适合持续测量，添加试剂后就读取该板信号，然后再处理下一块孔板。ONE-Glo™和ONE-Glo™ EX检测系统所产生信号的半衰期介于Bright-Glo™和Steady-Glo®检测系统之间。鉴于信号半衰期≥50分钟，因此可进行持续处理或处理小批量多块孔板。ONE-Glo™ EX检测系统的室温稳定性更佳。图1比较了二代萤火虫萤光素酶检测系统信号的明亮度和信号半衰期的差异。
上图. 5种单光动态FLuc报告基因检测系统对比。如需获取更多详细信息，参见说明书TM432。Dual-Glo®萤光素酶检测系统仅指萤火虫萤光素酶检测试剂。
产品列表（点击产品名称可查看详情）
1. ONE-Glo™ EX Luciferase Assay System
（目录号：E8110, E8120, E8130, E8150）
2. Bright-Glo™ Luciferase Assay System
（目录号：E2610, E2620, E2650）
3. Steady-Glo® Luciferase Assay System
（目录号：E2510, E2520, E2550）
（目录号：E1500, E1501, E4030, E4530, E4550）
（目录号：GM3000）
也可使用海肾萤光素酶（RLuc）报告基因构建假病毒颗粒。Pfaender等人（6）选择了RLuc报告基因制备假CoV病毒，并选择了Renilla Luciferase Assay System测量发光信号。Renilla Luciferase Assay为第一代检测系统，因此添加检测试剂前，先需制备裂解物。该系统的通量较低，与使用Luciferase Assay System测量萤火虫萤光素酶具有的缺点相似。
还可选择 Renilla-Glo® Luciferase Assay System，该系统为二代检测系统。这种二代检测系统产生的初始发光信号较弱，但信号半衰期≥60分钟。
EnduRen™和ViviRen™活细胞底物这两种试剂可用于活细胞内RLuc活性的动态测量。两种试剂均为修饰后腔肠素分子，其在细胞内经生物活化后可形成腔肠素底物。两种试剂均可添加至培养基中，且可于任何适宜时间点进行测量。EnduRen™底物可产生中等强度的信号，但适用于持续时长达24小时的实验。ViviRen™底物可产生明亮的信号，但信号衰减速率较快，因此仅适用于持续时长短于1小时的实验。
产品列表（点击产品名称可查看详情）
1. Renilla Luciferase Assay System
（目录号：E2810, E2820）
2. Renilla-Glo® Luciferase Assay System
（目录号：E2710, E2720, E2750）
3. EnduRen™ Live Cell Substrate
（目录号：E6481, E6482, E6485）
4. ViviRen™ Live Cell Substrate
（目录号：E6491, E6492, E6495）
NanoLuc® 萤光素酶是一种基于深海虾萤光素酶逐步开发而来的的小分子（19kDa）酶，其与优化后底物furimazine结合时，产生的信号强度约为FLuc或RLuc的100倍（6）。小分子萤光素酶广泛用于生产重组病毒（7），包括MERS（8）、SARS-CoV（8）和SARS-CoV-2（9）。NLuc-SARS-CoV和NLuc-MERS-CoV早期研究证据表明，瑞德西韦可用于治疗COVID-19（10）。
洛克菲勒大学的Robbiani等人（11）选择使用HIV病毒颗粒和NLuc报告基因构建表达SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒，从而提高高通量应用场景的灵敏度。假NLuc病毒已被用于评价超100例个体的恢复期血清中和抗体。在洛克菲勒大学研究团队协助下，Lui等人（12）证明了二聚ACE2是结合SARS-CoV-2表面存在的S蛋白三聚体的必需受体。与IgG Fc区相连的二聚ACE2胞外结构可阻断假病毒，而单体ACE2胞外结构域则不可阻断假病毒。有趣的是，在表达NLuc的假病毒研究中，细胞与Nano-Glo® Luciferase Assay System（目录号：N1110, N1120, N1130, N1150）混合前，已使用Cell Culture Lysis Reagent对细胞进行了裂解处理。
参考文献：
1. Walls, A.C., et al. (2020) Structure, function and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 181, 281-292.
2. Letko, M., Marzi, A. and Munster, V. (2020) Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat. Microbiol. 5, 562-9.
3. Ou, X., et al. (2020) Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat. Comm. 11, 1620.
4. Xia, S., et al. (2020) Inhibition of SARS-CoV-2 infection (previously 2019-nCoV) by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion. Cell Res. 30, 343-55.
5. Pfaender, S., et al. (2020) LY6E impairs coronavirus fusion and confers immune control of viral disease. bioRxiv posted 7 Mar 2020.
6. Hall, M.P., et al. (2012) Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazo-pyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7, 1848-57.
7. Hooper, K. (2018) Size does matter: NanoLuc® Technologies advance virology research.
8. Sheahan, T.P., et al. (2017) Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses. Sci. Transl. Med. 9, eaal3653.
9. Dinnon 3rd., K.H., et al. (2020) A mouse-adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID-19 medical countermeasures. bioRxiv posted 7 May 2020.
10. Hooper, K. (2020) Investigation of remdesivir as a possible treatment for SARS-2-CoV (2019-nCoV). Promega Connections blog.
11. Robbiani, D.F., et al. (2020) Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 infection in covalescent individuals. bioRxiv posted 22 May 2020.
12. Lui, I., et al. (2020) Trimeric SARS-CoV-2 Spike interacts with dimeric ACE2 with limited intra-Spike avidity. bioRxiv posted 21 May 2020.
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节目名称：利用结构计算模型预测有效的PROTAC三元复合物
播出时间：2022年4月
麦主播：库库甲谷
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通过初级评审的选手可获得随行咖啡杯一个
通过大众评审，成为麦主播的选手，
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该活动最终解释权归Promega所有！
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萤光素酶有声故事汇 萤光素酶生物发光技术从自然界到实验台，每一步的变化都有着无数的故事和科学家的努力。跟随我们的脚步，慢慢聆听生物发光技术的前世今生和最新的技术进展。 |
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