讲座主题：生物发光活体成像技术及应用
讲座精彩内容：
1. 生物发光与荧光成像的方法学比较
2. 生物发光活体成像的流程
3. 如何选择报告基因及成像底物
4. 应用案例解析
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解答
生物发光活体成像技术及应用Q&A
1
标记细菌后，用细菌喂食动物，原则上动物会消化
细菌，再喂食萤光底物，可行？
如果是用萤光素酶标记细菌，那么喂食动物后预期动物是否会消化破坏这个细菌？如果是，那这个萤光素酶可能会被消化道里的各种蛋白酶降解。如果这种细菌可以在消化道里存活，那您还需要考虑投喂的底物是否可以稳定存在于消化道中的环境，能否稳定到达存活的细菌中进行反应，这个反应的时程会有多久等等。建议您查找是否有相关文献可参考。
2
如果想持续观察动态变化，每天重复注射底物，对
动物影响大吗？
有发表的文章中记载了反复给动物注射底物来进行多次观察
（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2713342/），但并没有探讨这个操作本身是否会对动物有影响。从细胞水平的实验来看，高质量的D-luciferin或者Furimazine等，在短时间内并没有显著的毒性。另外，除了注射底物，成像时通常还需要对动物进行麻醉，如果您希望重复检测，可能还需要考虑整个过程中其他操作可能产生的影响。
3
小鼠分不同时间照活体成像，比如1day，3days，
7days，是每次都需要重新注射底物吗？注射一次
能维持多久？
有发表的文章中记载了48h内反复给动物注射底物来进行多次观察（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2713342/）。如果您希望在不同时间进行活体成像，需要每次进行底物注射，每一次注射后的成像时间窗口（此时发光信号约为最大值的95%以上）会与您注射的底物量和注射方式有关，但都不会持续太长时间，通常可能是10-20min，之后信号会快速降低。
4
如何把萤光素酶报告基因标记到病毒上，能再分享
下文献？
通常作者是从商品化载体上扩增所需的萤光素酶编码序列，然后克隆到病毒表达载体或病毒基因组中。相关文献示例：
In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5449660/）
5
除了细胞和小鼠，在低等无脊椎动物中可用么？
萤光素酶报告基因理论上应当也可以用在其他物种，不过对于未报道过相关应用的物种，使用者需要预实验验证是否有内源蛋白干扰，以及萤光素酶报告基因是否能有效表达等。
有文献使用报告基因GFP-aequorin进行果蝇脑内钙信号的体内生物发光成像研究，供参考：
6
如果只是活细胞成像，还需要成像底物吗？可以直
接用荧光蛋白吗？
如果是萤光素酶报告基因标记，那么不论是细胞成像还是活体成像，都需要添加对应的底物，才能产生发光。根据实验的具体情况，可以选择用萤光素酶或荧光蛋白进行标记。
7
Nonaluc®的分辨率多大？能达到细胞亚器官水平么？
Nluc可以在活细胞内产生发光，为融合蛋白的亚细胞位置成像提供足够的信号强度，但同时，这需要使用者配备高分辨率和灵敏度的成像仪器，例如Olympus LV200。应用示例请参考：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3501149/
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(18)30118-4#relatedArticles
8
NanoLuc®萤光素酶有用于植物的case吗？
链接文献中描述了Nanoluc® luciferase在拟南芥中的应用，供参考：
9
请问luc和luc2有什么区别？
这两个基因名称都是指萤火虫萤光素酶编码序列(CDS)的不同版本。
Luc指的是萤火虫本身的CDS/蛋白，来自Photinus pyralis。它在Promega的第一代报告基因载体pGL2和其他公司销售的载体中使用。Promega对这个版本的编码序列进行了一些定点突变，产生了luc+，这是我们在pGL3载体系列中使用的版本。我们对密码子进行了一些优化，主要区别是去掉了天然萤光素酶蛋白中编码过氧化物酶体定位信号的序列。这使得luc+相对于原生luc的表达显著增加(10到20倍)。
Luc2是我们最新版本的优化萤火虫萤光素酶，在我们的pGL4系列载体中使用。这个版本由luc+为基础，并包含了两个显著的改进。首先，对该序列进行密码子优化，使其表达量显著增加(相对于luc+约增加5 ~ 10倍;相对于天然luc ~200倍)，所以它更敏感。其次，我们“清理”了这个CDS (以及pGL4载体)，以去除绝大多数潜在的调控序列(例如，转录因子结合位点)，以降低本底表达水平，并大大降低脱靶效应(检测伪迹)的机会。需要注意的是，luc2产生的蛋白与luc+产生的蛋白相同，都缺少氧化物酶体定位信号。更多的相关信息请查阅pGL4系列的产品说明书。
更多资源
活体成像底物产品信息
*产品详情及其他产品规格请前往Promega微网站查询
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小动物活体成像底物
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