一项发表于《Nature Chemical Biology》的最新研究表明，癌症中最常见的突变蛋白质可能并不像以前认为的那样“不可成药”。Promega研发科学家与加州大学旧金山分校Kevan Shokat带领的研究小组合作，开发了KRAS基因突变体的新策略，这些突变体在以前的药物研发工作中都没有成功。他们的文章为开发小分子抑制剂开辟了新的可能性，这些小分子抑制剂主要针对于KRAS（G12D）和其他具有临床意义的突变体。

KRAS是一类小型GTP酶，其是细胞增殖功能的一个主要开关。当基因发生突变使这个开关持续停留在“开启”状态时，细胞就会不可控制地生长和分裂。此前的研究发现，至少有15%的人类癌症是由KRAS突变引起的。

不幸的是，小分子药物很难靶向KRAS。该蛋白质呈球状无明显的药物结合特征，因此多年来一直被认为是完全“难以成药”的。2013年，Shokat实验室通过证明KRAS（G12C）（一种甘氨酸氨基酸被半胱氨酸取代的突变体）对非共价抑制剂敏感，改变了这一广泛认知。这些分子与一个称为开关-II口袋（switch-II pocket，SII-P）的区域相结合，使KRAS（G12C）突然间变为了有成药希望的靶点，并在此后开发了多种靶向该突变体的抑制剂。FDA于2021年5月批准了首个KRAS抑制剂，sotorasib。

然而，用于KRAS（G12C）的该项策略无法应用于其他突变体。作为一类GTP酶，KRAS的活性GTP结合状态与非活性GDP结合状态相比，只显示出轻微的构象变化。KRAS（G12C）保留了野生型蛋白具有的活性/非活性状态循环，其抑制剂依赖于与非活性GDP状态的结合。其他具有临床意义的突变体，如KRAS（G12D）和KRAS（G12V），几乎所有时间都处于活性GTP状态。KRAS（G12D）和KRAS（G12V）是两种最常见的KRAS突变体，靶向该突变体的药物需要作用于KRAS的GTP结合状态。

一项发表于《Nature Chemical Biology》的新研究表明非共价配体可以结合许多热点KRAS突变体的SII-P。这种结合不依赖于蛋白的GDP状态，并且可减少细胞增殖。

该团队使用核磁共振（NMR）光谱来评估一组配体与野生型KRAS，以及KRAS（G12C）和KRAS（G12D）的结合。研究发现，之前可与KRAS（G12C）共价结合的配体，在野生型KRAS和KRAS（G12D）的非活性状态下表现出非共价亲和力，但在其活性GTP结合状态下无法表现出亲和力。他们还分析了Mirati Therapeutics开发的可抑制KRAS（G12D）的化合物，发现该化合物对野生型KRAS和KRAS（G12D）的GDP和GTP结合状态均表现出非共价亲和力。

之后研究人员使用NanoBRET Targe Engagement Assay定量分析了体内KRAS靶向参与作用。该试验使用生物发光共振能量转移（BRET）来定量检测活细胞中的靶点占有率、化合物亲和力、保留时间和渗透性。靶蛋白与NanoLuc^®萤光素酶（荧光素酶）融合表达。然后将具有细胞渗透性的荧光示踪剂添加至样品中，其可逆性结合靶蛋白。当示踪剂靠近NanoLuc^®萤光素酶（荧光素酶）时，会产生BRET信号，该信号可在GloMax^® Discover微孔板读数仪上进行测量。若测试化合物与示踪剂竞争，则信号丢失。该试验在活细胞中进行，产生的结果更接近模拟化合物在人体中的行为方式。

NanoBRET Target Engagement Assay试验结果表明MRTX-EX185对KRAS（G12D）和其他多种有临床意义的突变体具有高度效力。使用CellTiter-Glo 2.0进行的进一步分析表明，这种结合产生了抗细胞增殖作用。虽然该分子以与已知KRAS（G12C）抑制剂相似的方式与SII-P结合，但这种结合不依赖于与半胱氨酸残基硫醇的共价结合，也不依赖于非活性GDP的结合状态。

正如两位作者在《Nature Chemical Biology》上发表的评论所述，这些结果表明KRAS不再被几十年以来一直认为的是“不可成药”。文章中展示的方法提供了一个完整的工作流程，其可用于在小分子药物发现过程中剖析KRAS抑制剂的靶标参与作用。文章作者希望他们的工作可以为今后癌症治疗领域关于KRAS突变体的发展带来帮助。