NanoBRET™ Target Engagement (TE)利用BRET检测原理在多孔板中定量测定化合物与活细胞中靶蛋白的结合（亲和力和占有率）。

BRET检测原理为：NanoLuc^®萤光素酶与可透过细胞的荧光示踪剂（与靶蛋白-NanoLuc融合蛋白结合）之间发生的发光能量转移。由于BRET检测法通过对能量供体（NanoLuc^®）与能量受体（示踪剂）之间的紧密距离限制进行检测，因此NanoBRET™ TE检测法可对与NanoLuc融合的靶蛋白进行特异性测定。

点击下方视频查看技术原理：

当符合以下条件时，可实现化合物亲和力定量测定：

 • [示踪剂] ≤ Kd-表观，已为每一种激酶提供示踪剂表观Kd值

 • [靶蛋白] << 化合物Kd-表观，通过低水平表达激酶来实现

激酶专用应用说明提供检测条件

NanoBRET™ TE Kinase专用应用说明通过提供检测条件（包括Kd）实现快速启动：

当使用的示踪剂浓度≤ Kd，化合物IC50接近Ki表观

因此，NanoBRET™ TE测量的不仅仅是效价排序。

将BRET比率转换为部分占有率

NanoBRET™ TE可通过以下方式对化合物占有率进行定量测定：

• 使用背景(Z)和max (Y) BRET对照组

• 将样品的BRET比率(X)转换为占有率

• 部分占有率允许定量检测针对多种激酶的化合物选择性

NanoBRET™ Target Engagement Kinase Assay工作流程

在多孔板中进行的“仅添加”细胞分析方法可从96孔扩展到384孔。

涵盖激酶组中>350种激酶的活细胞检测，包括全长野生型和突变型激酶。每种激酶都有测定条件和可用数据。

•  NanoBRET™ TE Kinase Assays可用来表征I型、II型和变构（III型和IV型）激酶抑制剂，如ABL1和RIPK1激酶（A和B）。

•  使用NanoBRET™ TE评估了野生型MET和临床MET突变体D1228V与多种I型和II型激酶抑制剂的结合能力。I型抑制剂卡马替尼和赛沃替尼与WT MET有效结合，II型抑制剂也观察到了相同的结果（C）。MET（D1228V）突变体虽然没有与这些I型抑制剂结合，但保留了与II型抑制剂格来替尼、福瑞替尼、梅沙替尼和卡博替尼结合的能力。

• 除了与多个细胞周期蛋白Y CDK（CDK 14-18）结合外，迪那西利的细胞选择性特性还确定了CDK 1-6和CDK9的主要靶点。迪那西利的细胞内效价取决于细胞周期蛋白配对（A）。

•  选择性CDK抑制剂阿贝西利的细胞选择性特性确定了CDK 4和CDK 6的主要靶点。另外它还与CDK14-18结合。阿贝西利的细胞内效价取决于细胞周期蛋白配对（B）。

•  使用NanoBRET™ TE测定多靶点激酶抑制剂克唑替尼的细胞选择性（A）。主要靶点MET和ALK表现出了最强的亲和力。

•  NanoBRET™ TE Assays可以针对多种激酶测定克唑替尼的细胞选择性，这是因为：

—NanoBRET™ TE Assays可以对化合物亲和力进行定量测定，不仅仅是测定效价排序；

—NanoBRET™ TE Assays可以对>350种激酶进行测定。

•   NanoBRET™ TE数据与phospho-ELISA等细胞功能检测有良好的相关性（B）

•   NanoBRET™ TE检测方法与一些功能检测相比更有针对性和可扩展性。

• 使用NanoBRET™ TE，通过实时动力学分析评估细胞内滞留时间（A）。

•  慢性髓性白血病（CML）的治疗药物伊马替尼（第一代）与达沙替尼和帕纳替尼（第二代和第三代药物）相比，在ABL1处表现出更弱的结合能力（B）和更短的滞留时间（C）。

•  帕纳替尼的亲和力（B）与达沙替尼相似，但滞留时间（C）比达沙替尼更长。