关键词：pHAb dye，pH敏感染料，抗体标记，抗体内化，抗体偶联，高信噪比，高通量。
快速了解本篇文章介绍重点。
背景介绍
受体介导的内化是抗体药物偶联物（ADCs）的重要作用机制（MOA）。然而，当前研究抗体内化的方法存在多种局限性：
● 多步骤流程不适用于大规模筛选；
● 信噪比低；
● 不适合进行动力学测定。
Promega开发出一种克服传统内化检测实验相关问题的方法。该方法主要包括：
● 使用一种水溶性、亮度高且光稳定性好的pH传感器染料（pHAb），用于研究抗体的内化；
● 一种经过优化的方法可以直接从细胞培养基中将pHAb染料与抗体偶联；
● 设计了一种96孔板为基础的高信噪比检测体系，可用于：
(a) 实时监测抗体的内化过程；
(b) 对抗体内化能力进行筛选。
pHAb dye-抗体偶联
01
pH Sensor Dyes (pHAb Dyes)
pHAb染料具有两种不同的活性基团，分别用于与伯胺或硫醇反应性基团发生反应。
产品信息：
02
磁珠上抗体-pHAb染料偶联
● 直接使用含有抗体的细胞培养基进行实验，无需纯化抗体用于偶联；
● 可以并行标记多个样本（1-96个）；
● 样本体积范围：1-50ml。
数据展示
01
抗体-pHAb偶联物的特性表征
通过基于磁珠的方法，直接从细胞培养基中将各种小鼠IgG2a样本与pHAb染料偶联。
● 染料偶联后高抗体回收率；
● 抗体-pHAb染料对pH变化作出响应。
使用ELISA测定Cetuximab在与pHAb染料偶联前后的亲和力。
● 将pHAb染料偶联到抗体上没有改变抗体的活性。
02
实时监测Trastuzumab-pHAb偶联物的内化
● 将Trastuzumab（anti-HER2）与pHAb染料进行偶联；
● 用30nM的Trastuzumab-pHAb染料偶联物处理SKBR3细胞；
● 使用共聚焦显微镜每60分钟捕捉一次图像，监测内化过程。
03
明亮的pHAb染料能够进行96孔板等基于孔板的检测
优势：
● 简单的实验流程：加入-更换培养基-读数；
● 卓越的信噪比。
04
使用基于孔板的检测方法来定量内化作用
抗体浓度的影响
将Trastuzumab与pHAb染料偶联物的浓度进行梯度稀释后加入到96孔板中表达HER2的SKBR3细胞或MDA-MB231细胞（阴性对照）中。孵育24小时后，使用荧光读板仪测定内化抗体的荧光。
将Cetuximab与pHAb染料偶联物的浓度进行梯度稀释后加入到96孔板中表达EGFR的A431细胞或MCF7细胞（阴性对照）中。经过24小时孵育后，如上所述测定了信号。
基于孔板定量的优势：
● 易于操作且具有可重复性；
● 可以比较多种抗体及其亚型的效力；
● 卓越的信噪比。
05
内化速率和竞争检测
Trastuzumab-pHAb内化速率
Trastuzumab-pHAb染料偶联物与表达HER2的SKBR3细胞或MCF7细胞（阴性对照）在96孔板中共同孵育不同时间。内化作用随时间的变化在96孔荧光板读板仪中读取。
竞争测定是通过检测未偶联的抗体对偶联有pHAb染料的抗体内化作用的抑制来进行的。
06
结论
● 一种新的、水溶性、明亮且光稳定的染料，可用于与抗体偶联。适用于与胺或硫醇反应基团反应。
● 一种基于磁珠的偶联方法，可直接从细胞培养基中标记抗体。
● 一种可重复的基于孔板的测定法，可以根据受体介导的内化特性进行抗体的筛选和排序。
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