液体生物样本ccfDNA的富集与纯化
以及生物标志物的检测
游离DNA提取
介绍
使用循环游离 DNA(ccfDNA) 作为癌症生物标志物的一个主要障碍是获取纯化样本的困难。来自基因组 DNA(gDNA) 的污染可能会影响ccfDNA的含量，并对关键突变的敏感检测产生影响。Promega使用ProNexTM Size Selective 纯化系统演示了即使在高度污染的样品中也可以高效去除gDNA。这种方法可以用于浓缩生物液体样本，以改善对稀有遗传事件（如微卫星不稳定性）和关键致癌基因突变的检测。
使用三例结直肠癌肿瘤患者的血浆样本，比较微卫星不稳定性（MSI）分析和FFPE 和ccfDNA中的NGS变异检测。
方法
从三名患有结直肠腺癌（分别标记为A、B、C）的个体中获得了匹配的正常相邻FFPE组织、肿瘤FFPE组织和血浆样本。按照下图中所示流程进行样本核酸提取和MSI分析。
基于扩增的 DNA 定量
使用ProNex DNA QC试剂盒系统测量DNA浓度。该系统是一种基于qPCR的方法，具有针对人类DNA的目标片段（长度为75、150和300 bp）以及内部阳性对照。使用150bp目标片段进行DNA定量分析。
结论：从石蜡样本和血浆样本中高效提取DNA。每个样本都获得了足够的可扩增的、大于 150bp 的 DNA 进行 MSL 和测序。
DNA 质量与大小
每个样本中75bp到300bp扩增产物的比例用于估计DNA完整性。ccfDNA 和FFPE 样本类型具有高度碎片化的样品。对DNA完整性的分析对于准确针对下游应用的输入模板量很重要。
上图：图A. 用于表征 DNA 完整性的 DNA 质量控制试验的图解。B. 通过多重实时荧光定量 PCR 测得的单个个体中 75 到 300 base-pair 的扩增产物的代表性比值。C. 在具有或不含有大小选择的情况下，ccfDNA 的平均 75/300 倍比。每种条件有 3 个。D. 使用 Agilent TapeStation 和 D1000 高灵敏度筛网带运行样品的代表电泳图。
结论：DNA 质量控制试验中使用的 75/300 基对扩增片段比可以估计 DNA 的完整性。大小选择可减少 ccfDNA 中大分子 DNA 污染。
MSI 分析
使用两种 MSI 分析系统，从肿瘤组织、正常相邻组织以及循环游离 DNA 中提取的 FFPE 样本进行微卫星不稳定性分析。
箭头表示一个新的单核苷酸峰(最大高度>500bp)，与正常组织相比存在的等位基因偏移超过2bp
使用选择大小的ccfDNA从所有三个样本中获得了完整的MSI概况。在ccfDNA中未发现MSI，这可能是因为这些肿瘤都是局部局限性的，并且可能脱落DNA含量不够（AB样本为1A期，C样本为3A期）。
结论：使用两种MSI分析系统对FFPE和ccfDNA样本进行MSI分析是成功的。
NGS质量
使用 Illumina 的 TruSeq Custom Amplicon Low Input Kit 进行了二代测序。
使用定制的TruSeq Amplicon Assay对每个样本进行了成功的分组对9个基因进行全外显子测序，平均覆盖率为89%，432个扩增子，目标长度为33,000bp。
结论：成功对石蜡包埋样本和循环游离 DNA 样本进行了靶向外显子测序。
变异检测
使用Illumina TruSeq Custom Amplicon 应用程序在BaseSpace测序中心进行了序列分析。
A. 单核苷酸多态性对比较：每个组织中的所有单核苷酸多态性 (SNV) 的一对比较。使用 BaseSpace评估工具进行分析。
B. 肿瘤变异读取频率：体细胞变异被定义为正常对照组织中不发生变异，并且总读深度大于500。所有体细胞突变的平均体细胞变异读取频率（以总读数的分数表示），归一化到总读数深度。
C. 样本中检测到的生殖系变异：在正常和肿瘤FFPE样本中检测到超过15%的常染色体变异。
结论: 在循环游离 DNA 中可以检测到生殖系特异性和肿瘤特异性变异。
文献支持
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产品信息
Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit
Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit（AS1840）是一款用于自动化纯化循环游离DNA（ccfDNA）或循环肿瘤DNA（ctDNA）的试剂盒，与Maxwell® RSC系列仪器配套使用，能够从0.2至1.0毫升的小体积血浆样本或2至8毫升的大体积血浆中高效提取ccfDNA。此试剂盒设计了简单易操作的三步或五步纯化流程，大大减少了预处理步骤，使得科研人员能够快速、方便地获得高质量、可扩增的ccfDNA。
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目录号 |
规格 |
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AS1480 |
<1ml |
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AS1840 |
Large Volume |
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仪器信息表
所有Maxwell®核酸提取仪系列分为1-24通量和1-48通量两种型号的仪器，都带有去污染的紫外线灯和平板电脑的配置。同时可根据需求选配核酸定量用的荧光计仪器QuantusTM Fluorometer。
我们为任何Maxwell®仪器和试剂提供技术服务。如需要更多仪器信息和购买仪器，请拨打下方电话与我们联系。
010-58256268
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关于Promega公司
Promega Corporation是一家为生命科学行业提供高质量解决方案和技术支持的全球领先生物技术企业。在其44年的历史中，Promega已建立了包含有4000多种支持细胞和分子生物学的目录产品和定制产品的组合。如今，Promega开发的萤光素酶(即荧光素酶)等技术推动了活细胞分析、药物发现、分子诊断和人体识别等领域的创新，并且由实验室科学家和技术人员用于学术和政府研究、法医学、制药、临床诊断以及农业和环境检测。Promega总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16个国家设有分公司，拥有50多家全球经销商。如需获取更多信息，请访问www.promega.com。
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