古逆转录病毒与现代癌症：

内源性逆转录病毒在肿瘤细胞转录变化中的作用

大约3000万年前，一种逆转录病毒整合到了狒狒、大猩猩、黑猩猩和人类共同祖先的生殖细胞系中。这种内源性逆转录病毒，现在被称为伽马逆转录病毒人内源性逆转录病毒1（HERV-1），可能为我们揭示肿瘤细胞生长和生存所依赖的基因转录异常调控提供了线索。

关键词：双萤光素酶报告基因，NanoLuc^®萤光素酶（NLuc），细胞凋亡，细胞活力，CRISPR敲除技术，基因调控，癌症发展及治疗。

科学家们长期以来一直在描述癌细胞与正常细胞之间在基因表达、信号传导活性和新陈代谢方面的显著差异，但导致这些差异的根本机制尚未完全明了。在Ivancevic等人最近发表在《科学进展》杂志上的一篇文章中，来自科罗拉多大学博尔德分校、科罗拉多大学安舒茨医学园区以及科罗拉多大学医学院的研究人员报告了他们识别了可能解释癌细胞中基因表达变化背后的生物学事件的内源性逆转录病毒元件的努力。

研究人员假设转座子（TEs），特别是与内源性逆转录病毒相关的那些，可能参与了癌症特异性的基因调控。内源性逆转录病毒（ERVs）是远古逆转录病毒感染后残留在宿主生殖细胞系中的痕迹。

识别影响癌症基因表达的内源性逆转录病毒元件

接下来，Ivancevic及其同事进行了一系列功能研究以理解LTR10元件在转录调控中的作用。由于他们的分析显示转录因子AP1结合到LTR10元件，并且LTR10的转录活性与AP1因子FOSL1相关（这是与几种癌症相关的第二个转录因子），他们使用报告基因实验测试了当AP1/MAPK信号通路被破坏时，LTR10的活性是否受到影响。

研究人员使用NanoLuc^®萤光素酶和pGL4.50萤光素酶报告载体来研究LTR10元件的增强子活性。他们使用FuGENE^®转染试剂将含有LTR10序列的质粒转染到HCT116 CRC细胞中。使用Nano-Glo^® Dual-Luciferase^® Reporter Assay System测量发光强度。发光读数归一化到共转染的组成型表达活性萤火虫萤光素酶报告基因，然后数据以相对于只携带最小启动子的pNL3.3空载体转染的细胞的变化倍数表示。

这些细胞分别用TNFα或cobimetinib（MEK1抑制剂）处理，以刺激或抑制信号传导。实验结果显示LTR10元件具有显著的增强子活性，驱动癌症细胞中的基因表达。带有随机排列的AP1识别元件的构建体作为对照，显示了较低的活性，这突出了AP1识别元件在LTR10增强子功能中的重要性。

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基于基因表达研究，他们随后使用CRISPR敲除技术探究了HCT116 CRC细胞中的LTR10元件如何调节基因表达并参与癌症进展。利用CRISPR/Cas9技术，他们在HCT116细胞中创建了特定LTR10元件的靶向敲除。靠近LTR10元件的基因表达水平的变化有助于确定可能受LTR10增强子调控的基因。

为了获得更多关于潜在的LTR10增强子调控目标的信息，他们使用RNA测序寻找LTR10敲除后的基因表达变化。这些实验鉴定出如ATG12、XRCC4和VCAN等基因作为LTR10调控的目标，这些基因已知与癌症发展和进展有关。

ATG12编码一种对于巨自噬、线粒体稳态和凋亡必需的蛋白。ATG12的表达与癌症发展和药物耐药性相关。为了确定LTR10.ATG12增强子是否调节HCT116细胞中的ATG12基因表达，研究人员首先检查了增强子沉默是否会降低细胞中ATG12蛋白水平，结果确实如此。

他们随后用staurosporine（STS）处理细胞以触发线粒体凋亡。使用Caspase-Glo^® 3/7 Assay评估，增强子被沉默的细胞显示出减少的caspase-3/7活性。caspase 3和7是参与凋亡起始和执行的酶。

XRCC4是一个与肿瘤对化疗和放疗抵抗相关的DNA修复基因。VCAN编码一个与肿瘤转移相关的细胞外基质蛋白。研究XRCC4的LTR10增强子，它调控这两个基因的表达，研究人员探究了敲除该增强子是否会影响细胞对辐射的反应。使用CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay，他们评估了敲除细胞与野生型细胞在暴露于辐射后的存活能力，并发现敲除细胞的存活率低于野生型细胞。

Ivancevic, A. et al. (2024) Endogenous retroviruses mediate transcriptional rewiring in response to oncogenic signaling in colorectal cancer. Science Advances 10(29).  

DOI: 10.1126/sciadv.ado1218

这些实验证据强有力地表明，通过其增强子活性，LTR10元件显著影响结直肠癌中的基因表达和细胞行为。这项工作强调了通常处于沉默状态的基因组中的转座子如何可以重新激活，导致异常基因调控、癌症发展和进展以及治疗抗性，并确定了一个癌症治疗研究中的潜在新靶点。