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来源：发布时间：2024/11/21 11:58:00

由快速高效的精氨酸特异性蛋白酶

(Arg-C Ultra) 改进的蛋白质组学方法

Promega最新推出了一种超高效且超特异性的蛋白酶，该酶在精氨酸残基的羧基端切割，并且可以产生几乎零错切率。这种 Arg-C Ultra 蛋白酶可以与 Lys-C 联合使用，生成优于胰蛋白酶或胰蛋白酶与 Lys-C 联合使用的“胰蛋白酶样”消化产物。

关键词：蛋白分析，蛋白组学，Arg-C Ultra 蛋白酶，Lys-C 蛋白酶，胰蛋白酶，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。

快速了解本篇文章介绍重点。

产品特点

Arg-C Ultra 蛋白酶具有极高的消化效率和特异性。其主要特点及应用如下：

● 是性能最好的质谱级蛋白酶。

• 特异性针对精氨酸。

• 可实现几乎100%的消化效率(错切率 <1%)。

● 在 6-8M 尿素和广泛的 pH 范围（约 5-9）中保持活性。

● 优于 Lys-C：

• 即使所需酶量更少，也能获得更高消化效率。

• 特异性更高。

• 即使在 6M 尿素中也更高效。

● 适用于生成治疗性蛋白的高覆盖率图谱。

● 适用于全面的翻译后修饰（PTM）映射，如组蛋白分析所示。

• 特别有助于监测赖氨酸残基上的或附近的PTM。

● 通过 DiGly 富集，可增加泛素化位点的鉴定数量。

● 与 Lys-C 联合使用时，Arg-C Ultra + Lys-C 的表现优于胰蛋白酶。

基本介绍

在自下而上的蛋白质组学研究中，蛋白质通过蛋白酶消化成肽段，随后使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鉴定。理想情况下，所使用的蛋白酶应既高效又特异，因为低特异性和/或低效的消化会通过增加样本复杂性和降低灵敏度来使 LC-MS/MS 分析复杂化。这里，我们描述了一种超高效且超特异性的蛋白酶Arg-C Ultra的应用。

使用 Arg-C Ultra 消化人类 K562 细胞提取物显示了比迄今为止测试的任何蛋白酶都更高的切割效率和特异性。组蛋白分析在没有进行预先衍生化（例如丙酰化）的情况下完成。获得了高序列覆盖率，包括 H2A、H2B、H3 和 H4 的基本 N 端尾区。特别是，核心组蛋白变体的整体序列覆盖率达到约 80% 或更高（最高约为 H2B 的 96%），观察到高消化效率（<1% 错切率）。对于通过 DiGly 富集的泛素化分析，结果显示，与仅使用胰蛋白酶相比，Arg-C Ultra 使识别到的 DiGly 残基位点数量增加了约 35%。

Arg-C Ultra 与 Lys-C 的组合在消化效率和特异性方面均优于胰蛋白酶或胰蛋白酶与 Lys-C 的组合，表明 Arg-C Ultra 在独立使用和“胰蛋白酶样”工作流程中都能提供显著的优势。

性能分析

Arg-C Ultra 具有卓越的消化特异性和效率

• 人类 K562 细胞提取物在 1:50 的酶:底物比例下过夜消化。

• 数据在 Orbitrap Exploris 240 上进行分析，并使用 Byonic进行搜索（未指定酶）。

● Arg-C Ultra 的消化特异性远优于标准 Arg-C。

● Arg-C Ultra 拥有所有质谱级蛋白酶中最佳的消化效率和特异性组合。

Arg-C Ultra 加上 Lys-C 的表现优于胰蛋白酶

• 人类 K562 细胞提取物分别用胰蛋白酶、胰蛋白酶/Lys-C 或 Lys-C 和 Arg-C Ultra 的混合物进行消化。

• 数据使用 Byonic进行搜索（未指定酶）。

● 将 Arg-C Ultra 与 Lys-C 结合使用的结果优于单独使用胰蛋白酶或胰蛋白酶/Lys-C。

● Arg-C 的消化特异性高于 Lys-C。

无需丙酰化即可改善组蛋白肽谱分析

使用 EpiQuik 总组蛋白提取试剂盒从小鼠小胶质细胞中提取组蛋白，用 Arg-C Ultra 进行消化，并通过 timsTOF Pro 上的 DDA-PASEF 进行分析。MS Fragger 搜索结果显示高序列覆盖率（涵盖 N 端尾部）和翻译后修饰（PTM）鉴定。

● Arg-C Ultra 消化允许检测含有翻译后修饰（PTM）和未修饰的同源组蛋白肽，从而实现准确的组蛋白 PTM 定量。

泛素化位点的增强覆盖

泛素化位点的鉴定

用胰蛋白酶或 Arg-C 消化泛素化蛋白质会在修饰的赖氨酸上留下一个 GlyGly 残基，该残基可用作与抗 GlyGly 抗体富集的把手。

由于 Arg-C Ultra 的高特异性，其消化产生的肽段将更长且与许多由胰蛋白酶消化产生的肽段不同。

K562 细胞用 10 μM MG132 处理 4 小时，以抑制蛋白酶体，实验设置三个重复。细胞裂解后，使用 Pierce Rapid Gold BCA 测定蛋白浓度。使用 SP3 磁珠，裂解物分别用胰蛋白酶/Lys-C 或 Arg-C Ultra在 37°C 下过夜消化。消化后的肽段使用 Waters Sep Pak tC18 脱盐。

200 µg 脱盐后的肽段用作基于 DiGly 的珠子富集（Cell Signaling）的输入样品。富集后的肽段在 Orbitrap Exploris 240 上使用 90 分钟的 DDA 梯度进行分析。数据使用 Byonic（Protein Metrics）进行搜索。将三次重复中的独特 PTM 位点合并，然后比较不同的蛋白酶消化方法。Arg-C Ultra 使鉴定到的总位点数量增加了约 35%。

● Arg-C Ultra 允许在 Di-Gly 富集后识别额外的泛素化位点。

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