使用 Arg-C Ultra 蛋白酶解锁 ADP-核糖基化的秘密：研究酯键连接蛋白修饰的关键酶

蛋白质的翻译后修饰对于蛋白质的正常功能至关重要。例如，磷酸化/去磷酸化可以作为开关，激活或失活信号级联中的蛋白质。细胞膜蛋白上特定糖的添加对于识别、与细胞外基质的相互作用和其他活动至关重要。尽管我们对某些类型的蛋白质修饰了解很多，但天冬氨酸和谷氨酸残基上的 ADP-核糖基化由于这些酯键连接修饰 (ester-linked modifications) 的化学不稳定性而更难以研究。

关键词：质谱级蛋白酶、蛋白质修饰、翻译后修饰。

最近，马蒂奇实验室（Eduardo José Longarini 和 Ivan Matić）发表了一项研究，探讨了由蛋白质 PARP1 介导的天冬氨酸和谷氨酸残基上的单 ADP-核糖基化（ADPr）及其可能由 PARG 反转。PARP1 和 PARG 信号通路在 DNA 修复和凋亡途径中起着核心作用，使其成为癌症或神经退行性疾病中 DNA 修复过程经常受损的潜在强大治疗靶点。

为了应对酯键连接修饰的不稳定性，马蒂奇实验室开发了一种方法，可以保持这些酯键连接修饰，从而使用抗体和质谱技术检测 DNA 损伤诱导的天冬氨酸/谷氨酸残基上的单 ADPr。在他们的实验流程中，细胞裂解时的温度调整为室温而不是 37°C。蛋白样品从未加热到高于室温，大多数情况下样品保持在 4°C。此外，他们缩短了蛋白消化的时间，并在酸性条件下进行。为了在低 pH 下实现有效消化，他们使用了 Promega 新推出的质谱级Arg-C Ultra蛋白酶。

Arg-C Ultra 在特异性和效率上优于标准 Arg-C 和胰蛋白酶。使用 1:100 的酶-底物比例，人 K562 提取物在 37°C 下与指定的蛋白酶过夜消化。肽段通过 Orbitrap Exploris™ 240（Thermo Fisher Scientific）进行 LC-MS/MS 分析。数据分析使用 Byonic 软件（Protein Metrics），未指定酶类型。

Arg-C Ultra 蛋白酶能够在温和的酸性pH值（约5.0）下进行蛋白质消化，这对酯键连接修饰更为温和。酸性环境不太可能水解酯键，从而使样品制备过程中易失的 ADPr 修饰得以保留。Arg-C Ultra 蛋白酶还提供了高度特异性和高效的切割，且所需时间显著缩短，减少了样品暴露在可能使酯键不稳定的条件下的时间。在这项研究中，通过最小化ADPr 修饰降解，使用 Arg-C Ultra 使得天冬氨酸和谷氨酸残基上的单 ADPr 检测灵敏度提高了大约 10 倍。这种增强的灵敏度使研究人员能够鉴定出超过 40 个高可信度的修饰位点，这对于这种类型的翻译后修饰来说是前所未有的数量。

作者能够证明，传统上认为只能断裂多聚 ADPr 链的 PARG 也可以在细胞中逆转酯键连接的单 ADPr。这一新方法使进一步研究各种酶介导的 ADP-核糖基化成为可能，并拓宽了检测酯键连接修饰（如酯键连接的泛素化）的范围。

这项工作为探索被低估的酯键连接修饰的作用提供了精细的工具，使人们能够深入了解细胞在分子层面上对损伤的响应。此外，理解这些翻译后修饰可能增强 PARP 抑制剂及相关疗法的开发，有望为 DNA 修复过程受损的情况（如癌症和神经退行性疾病）提供更精准和有效的治疗方法。

如果您想寻找可靠、高质量的酶和表面活性剂用于您的质谱研究，Promega 提供多种高质量的质谱试剂和工具，以协助您的研究。

1. Longarini E.J. and Matić I. (2024) Preserving ester-linked modifications reveals glutamate and aspartate mono-ADP-ribosylation by PARP1 and its reversal by PARG. Nat Commun. 15:4239. 

DOI:10.1038/s41467-024-48314-0

产品订购

Purchasing

资料下载

Resources