使用HaloTag® 技术对3D培养物模型进行动态活细胞荧光成像
HaloTag® 技术为蛋白质标记提供了一种开创性的方法，为研究人员提供了一个强大的工具，以无与伦比的精确度和灵活性研究蛋白质动力学。这项创新技术利用了 HaloTag® 蛋白，该蛋白能与合成配体形成共价键，这些配体可以轻松更换，以满足多种应用需求。这使得蛋白质可以迅速且可逆地标记上各种功能基团，如荧光染料、亲和标签和其他化学探针。
HaloTag 系统的高度特异性和稳定性使其非常适合实时、活细胞成像，能够详细追踪蛋白质的定位、相互作用和功能在复杂生物系统内的变化。通过提供一个强大且适应性强的平台，HaloTag® 技术显著增强了研究工具箱，推动了我们对细胞过程和蛋白质动力学的理解。
除了在细胞分析中的普遍应用，HaloTag® 配体在成像应用中提供了众多优势。这些配体可以使用更稳定和更亮的染料，支持同一目标的多色标记，适用于脉冲追踪实验等应用，并支持多个目标的多重成像。HaloTag® 蛋白与 HaloTag® 配体之间的强共价结合确保了稳定和持久的标记，即使在动态或活细胞环境中也能进行长时间的清晰和可靠的成像。这种多功能性还扩展到与超分辨率显微镜技术的兼容性，使 HaloTag® 配体成为在纳米级分辨率上可视化细胞结构的强大选择。
01
微球体成像
复杂的 3D 细胞模型，如微球体，相较于简单的 2D 细胞培养具有多方面的优势。3D 架构更接近生理相关环境，提供类似于实际组织的细胞异质性，并展示出 2D 培养中不可能出现的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这些 3D 模型为探索潜在的诊断和治疗方案提供了最佳条件。然而，这些生物学优势也伴随着一些成像挑战。由于体积较大，3D 细胞模型的显微镜技术在深度感知和结构中心细胞的可视化方面常常遇到困难。实时成像测量需要长时间的信号，通常持续数天，因为 3D 细胞模型的时间线较长。此外，在这些延长的成像过程中，微球体的活力不能受到影响。
最新的 Janelia Fluor® HaloTag® 配体设计为细胞成像中最亮和最强大的配体。下面我们将重点介绍 Promega 科学家如何成功使用 Janelia Fluor® HaloTag® 配体监测大脑微球体中的实时神经突生成。这些应用展示了 HaloTag® 技术在复杂实验设置中的多功能性和实用性，使研究人员能够更深入地了解神经发育和其他细胞过程。
02
监测大脑微球体中的实时神经突
生成
Promega 科学家对长时间测量微球体的神经元投射（神经突生成）感兴趣。为了追踪神经元投射随时间的变化，他们使用了 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白。第一步是确定哪种启动子（CMV 或 SYN1）在 3D 结构中实现了最佳的 HaloTag® 表达。使用 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白的优势在于，它可以通过分别结合 NanoLuc® 和 HaloTag® 技术，同时通过生物发光和荧光监测目标蛋白。实验中使用了两种不同的启动子（CMV 和 SYN1）。
为了实现这一点，测量了 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白中的 NanoLuc® 萤光素酶。在该实验中，类器官被感染了 AAV1-NLuc-HaloTag。感染的类器官被解离成 2D 培养物，使用 NanoGlo® Live Cell Substrate 测量解离类器官中的 NLuc 表达。向解离的类器官中添加了细胞外 NanoLuc® 抑制剂，以减少自发光并降低背景信号，从而使用标准发光仪敏感地检测细胞内 NanoLuc® 发光。在该实验中，收集的发光数据相当于由 CMV 或 SYN1 启动子驱动的 HaloTag® 蛋白的量，提供了一种特定蛋白质定量的方法（图 1）。
图1
图1. 从 2D 培养的解离的类器官收集的 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白的发光输出，使 CMV 启动子（蓝色）和 SYN1 启动子（红色）驱动下表达的 HaloTag® 蛋白得以特异性定量。
Promega 科学家利用 Janelia Fluor® HaloTag® 配体的亮度，测量了大脑微球体培养物（图 2 上图）中的纵向投射。为了直接测量神经突的生长，大脑微球体被转染了在 SYN1 基因启动子驱动下表达 HaloTag® 蛋白的 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白。存在于所有表达 SYN1 的大脑微球体细胞团中的 HaloTag® 蛋白被 Janelia Fluor® 646 HaloTag® 配体（HT1060）标记，显示为洋红色，而细胞核则用 NucBlue™ Live ReadyProbes™ 试剂（Hoechst 33342）标记，显示为蓝色。20 天大的微球体的荧光图像通过共聚焦显微镜捕获，如下图所示（图 2 下图）。
图2
图 2. 用 Janelia Fluor® HaloTag® 配体标记的大脑微球体。上：大脑微球体培养的低倍放大图像。下：应用了 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白的大脑微球体，该融合蛋白在 synapsin 1 (SYN1) 基因启动子驱动下表达 HaloTag® 蛋白，用 Janelia Fluor® 646 HaloTag® 配体（红色）标记。细胞核用 Hoechst 染色。该图像是在尼康 AX 共聚焦显微镜的 10X 物镜下获得的。
Janelia Fluor® HaloTag® 染料的一个标志性特性是其持久的信号。为了展示这一能力，科学家们探索了这些染料一次应用后的信号持续时间。微球体被感染了携带双报告基因表达的 AAV1，其中包括 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白。在 AAV 感染后第 11 天加入 Janelia Fluor® HaloTag® 配体，并在成像前再次用 NucBlue™ Live ReadyProbes™ 试剂对细胞核进行染色。图 3 显示了这些 20 天大（图 3.A）和 45 天大（图 3.B）的微球体的荧光成像。在 45 天时，单次应用的 HaloTag® 配体仍保持强烈的荧光信号，与 20 天时的荧光信号相当。这突显了 HaloTag® 配体在长时间内实时跟踪复杂细胞过程的有效性。此外，HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白对细胞无毒，提供了一种方法来观察长时间内的细胞现象。综合来看，HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白与 Janelia Fluor® HaloTag® 配体的联合使用，允许对大脑微球体培养中的蛋白质表达进行详细的可视化和量化。
图3
图 3. Janelia Fluor® HaloTag® 配体在单次添加后可在大脑微球体中保持两个月的荧光。A) 表达由 SYN1 启动子驱动HaloTag®-NanoLuc® 的大脑微球体。HaloTag® 蛋白用 Janelia Fluor® 646 HaloTag® 配体标记，细胞核用 NucBlue™ Live ReadyProbes™ 试剂（Hoechst 33342）标记。成像使用尼康 AX 共聚焦显微镜的 20 倍物镜进行。B) 在 A 中成像的相同大脑微球体在 45 天时再次成像。
03
总结
HaloTag® 技术为蛋白质标记提供了一种多功能的方法，使研究人员能够以卓越的精确度和灵活性研究蛋白质动力学。HaloTag® 技术的实际应用不仅限于传统成像，对于使用大脑微球体等高级细胞培养模型的实验方法也极为宝贵。在这些模型中成功整合 HaloTag®-NanoLuc® 融合蛋白展示了该技术的稳健性和适应性。通过结合荧光成像和发光测量，分子和细胞生物学研究继续在理解复杂细胞生物学方面取得进展。Janelia Fluor® HaloTag® 配体不仅提高了蛋白质标记的准确性和灵活性，还为诊断应用和微球体的实时纵向测量开辟了新的途径。通过不断突破蛋白质研究的可能性，HaloTag® 技术站在科学发现的前沿，为监测蛋白质提供了无限的可能性。
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Promega Corporation是一家为生命科学行业提供高质量解决方案和技术支持的全球领先生物技术企业。在其44年的历史中，Promega已建立了包含有4000多种支持细胞和分子生物学的目录产品和定制产品的组合。如今，Promega开发的萤光素酶(即荧光素酶)等技术推动了活细胞分析、药物发现、分子诊断和人体识别等领域的创新，并且由实验室科学家和技术人员用于学术和政府研究、法医学、制药、临床诊断以及农业和环境检测。Promega总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16个国家设有分公司，拥有50多家全球经销商。如需获取更多信息，请访问www.promega.com。
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