首先，将HaloTag蛋白融合标签添加到蛋白质中，将融合蛋白与众多可交换配体中的一个配对，这些配体与HaloTag形成高度特异性的共价键，就此打开了研究蛋白质功能的大门。一旦你感兴趣的蛋白与HaloTag蛋白融合，你就可以进行许多方面的应用，包括蛋白纯化、蛋白:蛋白或蛋白:DNA相互作用、细胞成像、受体内化等等。每个可能的分析途径都是基于您选择的可交换的HaloTag配体，或根据您的特定需求定制配体。
HaloTag克隆
Kazusa Genome Technology (KGT)是一个学术的日本研究机构，致力于致力于基因组规模研究和个体基因功能研究。Kazusa ORFeome项目的发起是为了创建一个人类和小鼠的ORFs库，从而为更大的科研群体提供可用的，高度验证的ORFeome。KGT是Global ORFeome Collaboration的成员之一 , 也是HUGE (Human Unidentified Gene-Encoded) 大蛋白方面的专家 (>4kb)。 Promega与KGT建立了合作伙伴关系，可为Promega客户提供Kazusa‘s的实验验证的ORFs克隆，加速您的研究进程。
Kazusa明白广泛验证的价值，为HaloTag® ORF克隆的客户提供给相应验证。
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| 荧光显微镜成像验证： 用HaloTag® TMR配基对HaloTag®融合蛋白原位标记和成像 | 表达验证： 以SDS-PAGE分析表达在HEK293细胞裂解物中的HaloTag®融合蛋白 |
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| 插入片段大小验证：通过琼脂糖凝胶电泳验证 | 测序验证：以单程测序的方法进行5‘和3’端的测序 |
| HaloTag®人的全长ORF克隆也可以功能相关基因的预制panels和整个9000+ HaloTag®ORF克隆文库的形式提供。这些克隆以大肠杆菌的预转化甘油储存液形式提供，具有与通过FindMyGene™可获得的单个ORF克隆相关的相同高质量标准。 |  |
蛋白定位、成像、运输和转运
HaloTag®技术为在活细胞中和体外进行快速、定点标记HaloTag®融合蛋白提供了新的选择。该技术基于HaloTag®蛋白和合成配基之间形成的共价键，这些配基具有多种功能，包括荧光标记、亲和标记和附着在固相载体上；而共价键在生理条件下可迅速形成，且具有高度特异性和本质上的不可逆，形成的复合物即使在变性条件下也是稳定的。因此，使用HaloTag®只需要一个可以表达的单一融合结构，用任何一种荧光分子标记，即可在活细胞或固定细胞中进行成像。
使用HaloTag®融合蛋白和HaloTag®荧光配基进行细胞成像。您可以对洗涤或未洗涤的细胞进行成像，以确定亚细胞定位。
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HaloTag®配基标记活细胞，之后进行固定。HaloTag®基因与3拷贝核定位序列融合后，稳定转染HEK293细胞，未转染的HEK293细胞作为对照；其中用HaloTag®TMR标记如图A所示， HaloTag® diAcFAM标记如图B所示， HaloTag® Coumarin 标记如图C所示或HaloTag® Oregon Green®标记如图D所示。
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超分辨显微成像技术
采用超分辨显微成像技术测定单细胞内的蛋白
超分辨显微成像技术是一种可利用荧光探针对细胞内低至蛋白等分子水平问题进行研究的技术。使用这种技术时，用户可实现细胞内荧光探针标记的分子，其位置的可视化，并观察它们之间发生的相互作用。这种技术可实现对活细胞内部以及亚细胞结构和细胞器相关蛋白的可视化，因此其可使用户对荧光探针标记特异性蛋白的生物学作用实现更为深入、全面的了解。HaloTag®技术提供了一种用明亮荧光染料共价标记靶蛋白的方法，从而更好了解相关蛋白在活细胞中的功能。
表征活细胞内的HaloTag®融合蛋白
超分辨显微成像技术所需的工具包括明亮的Janelia Fluor®549和Janelia Fluor®646 HaloTag®配体、细胞内表达的HaloTag融合蛋白及一台光学显微镜。Janelia Fluor®549 HaloTag®配体和Janelia Fluor®646 HaloTag®配体能够在内源性细胞环境中对HaloTag®融合蛋白进行表征。一旦与HaloTag®融合蛋白发生共价结合后，这些亮度增强的配体染料使得用户可通过以下方式检测和研究活细胞中的单分子：1.）荧光激活细胞分选术（FACS）；2）标准共聚焦成像技术；以及，3）用荧光成像仪进行凝胶检测。
供高分辨率活细胞成像技术使用的一次性Janelia Fluor®HaloTag®配体可实现：
- 单分子标记
- 快速细胞标记
- 高信噪比和特异性
Janelia Fluor®产品包括：
- Janelia Fluor®646和549
- Janelia Fluor®525、554、585、635、650
用户可将Janelia Fluor®配体用于诸如FACS、超分辨显微成像技术、STED显微成像技术和活细胞显微成像技术等应用。
将亲本U2OS细胞和表达HaloTag®（含有核定位序列）的U2OS细胞粘附至玻璃底腔室载玻片上，并使用200nM Janelia Fluor®646 HaloTag®配体标记15分钟。Fluor®646 HaloTag®配体在637nm的激光激发下，对细胞进行了成像。在表达HaloTag的细胞中，标记部位仅为细胞核。亲本细胞（图所示活细胞对照）显示未标记。该组图像的最上面一行仅为荧光信号。底行列出的是在同一相应激光激发波长处收集的透射图像，且荧光图像重叠。使用了配备NIS Elements软件和40X Plan Fluor油浸物镜的Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜进行图像采集。
蛋白纯化
大肠杆菌和哺乳动物细胞中的蛋白纯化
表达和纯化蛋白对了解蛋白功能而言非常重要。为利用HaloTag®技术分离蛋白，研发了可与合的成HaloTag®配体共价结合的34kDa经过修饰的细菌脱卤酶单体蛋白标签。
大肠杆菌中的蛋白纯化
制备靶蛋白的常用方法是用质粒转化大肠杆菌细胞并诱导蛋白表达。 这种重组蛋白通常带有一个标签，这有助于将其从大肠杆菌中发现的其他蛋白中提纯出来。HaloTag®介导的蛋白纯化技术以共价结合为基础，其甚至能有效捕获丰度较低的融合蛋白。通过这种共价结合方法，可进行多次洗涤操作，从而最终达到除去污染物的目的。事实上，经证实HaloTag®技术可提高大肠杆菌中可溶性蛋白的表达水平。
1. 基本原理
HaloTag®Protein Purification System以新型HaloTag®蛋白标签为基础，通过共价结合可有效且特异性捕获HaloTag®融合的靶蛋白。使用HaloTag®技术进行纯化，可获得高产量和高纯度的靶蛋白，而且不会残留HaloTag®蛋白标签。这一结果通过共价捕获融合蛋白及后续采用以下方法释放靶蛋白而实现：TEV蛋白酶切割HaloTag®Flexi®Vector中嵌入的优化TEV识别序列。
靶蛋白（POI）与HaloTag®蛋白融合，然后与HaloLink™Resin发生共价结合。这种共价交联方法可在严格洗涤条件下使POI附着在树脂上。洗涤后，通过TEV蛋白酶切割进行POI洗脱处理。
2. HaloTag®与其他蛋白标签系统的比较
在基于平衡反应的亲和纯化方法中，蛋白在两种状态之间不断变化，即与亲和树脂发生结合或不与之发生结合（例如，GST与GSH树脂结合，His-Tag®与Ni2+带电载体结合）。这可能会导致一些问题，比如当融合蛋白表达量低时，结合效率也随之降低，以及在多次洗涤过程中靶蛋白发生损失。此外，往往需要从靶蛋白除去GST和MBP等较大的融合标签，通常采用的方法是使用特异性蛋白酶进行切割及后续通过亲和方式除去游离标签。后一个步骤可能会存在一定问题，因为标签本身很难进行消除，因此其会成为最终纯化蛋白中的污染物。
以HaloTag®技术为基础的纯化方法，因其可共价捕获蛋白，因而非常适用于解决常见的蛋白纯化问题。
- 回收低表达蛋白。共价蛋白捕获导致固定化过程不可逆，因此融合蛋白的结合受表达水平的影响较小，从而可对低表达蛋白进行纯化。
- 高纯度蛋白，蛋白产量良好。HaloTag®捕获标签因共价永久性结合，在柱上TEV蛋白酶切割后仍留在HaloLink™Resin上，所以可进行多次严格洗涤，同时使靶蛋白损失降到最小。在除去TEV蛋白酶后，可回收靶蛋白，通常其产量高，纯度也较高。
- 除去多余蛋白。HaloTag®共价键强度较高，因此可在需要时进行严格洗涤，从而除去潜在的多余蛋白。
凝胶成像系统中，按照说明书（编号：TM312）中所述的批量/柱组合法，使用1ml沉淀的HaloLink™Resin从50ml培养物中纯化萤火虫萤光素酶（ffLuc）。SDS-PAGE分析结果显示，纯化蛋白的纯度高（>90%），通过比较E2和S-TEV中Coomassie®染色的ffLuc谱带强度，确定其回收率也很高。活性蛋白的回收率大于起始材料的75%（E2对比S-TEV），这表明其可有效捕获融合蛋白以及通过TEV蛋白酶切割实现蛋白释放。
哺乳动物细胞中的蛋白纯化
对于难以在细菌细胞中进行表达的蛋白，或者如果蛋白翻译后处理对下游应用而言较为重要，可在哺乳动物细胞中表达并从哺乳动物细胞中分离出标记蛋白。HaloTag®Mammalian Protein Purification System可从哺乳动物细胞培养裂解物中纯化HaloTag®融合蛋白。HaloTag®融合蛋白可与HaloLink™Resin形成高度特异性的共价键，甚至能够在培养的哺乳动物细胞中实现对表达水平较低的重组蛋白的良好纯化。与其他常见纯化方法（如FLAG®标签或His标签蛋白纯化）相比，HaloTag®-配体结合的特异性和强度可显著提高功能蛋白的产量和纯度。具体如下所示：
- 以最小的代价获得高纯度蛋白
- 与FLAG®和His标记方法相比，回收率更高
- 可从µg级扩大到mg级
- 便捷的荧光蛋白定量方法
1. HaloTag®Mammalian Protein Purification System概述
2. 以最小的代价获得哺乳动物细胞中的高纯度蛋白
Ohana等人使用HaloTag®Mammalian Protein Purification System分离出了高纯度、无标签的靶蛋白。与使用3xFLAG或His6tag系统等亲和标签获得的蛋白产量相比，使用HaloTag®系统时，蛋白回收率更高，产量也更高。此外，在纯化低丰度蛋白时，HaloTag®的表现也优于3xFLAG和His6tag系统。
根据凝胶成像系统所示，在HEK293T细胞（120ml培养物）中瞬时转染、表达，并用HaloTag®Mammalian Protein Purification System纯化了五种HaloTag®融合的人类激酶。
蛋白相互作用分析
蛋白间相互作用分析
了解哪些细胞分子发生相互作用有助于确定蛋白通路和参与基因表达的识别位点。HaloTag®Technology试剂盒可捕获直接和间接的蛋白质间相互作用，以及确定DNA结合位点和测定活细胞中的蛋白结合情况。
表征二元和高阶蛋白复合物
蛋白质间相互作用在细胞复制、转录、翻译和信号转导等过程中发挥着关键作用。HaloTag®Mammalian Pull-Down System用于捕获和纯化细胞内二元和高阶蛋白复合物，包括瞬时的或弱相互作用的伴侣蛋白。HaloTag®融合诱饵蛋白的共价结合代表其可捕捉所形成的细胞蛋白复合物，并识别更多生理相关的伴侣蛋白，而不受非特异性结合的干扰。
1. HaloTag®Mammalian Pull-Down System概述
2. 捕获相互作用的蛋白用于研究
使用具有特异性的p65-HaloTag®Pull-Down确定了NFκB通路中预期存在的细胞质二元和三元蛋白质间相互作用。采用质谱分析法鉴定的蛋白包括RelA（p65）、RelB、C-Rel、IκBa、IκBb、IκBe、p100、p105（p50）和p52。
研究活细胞中蛋白：蛋白相互作用
研究蛋白质间相互作用的动态变化颇具挑战性。使用NanoBRET™PPI Assay可在细胞条件下对诱导和抑制的蛋白间相互作用进行实时研究。基于生物发光共振能量转移（BRET）技术，即生物发光供体蛋白接近荧光标记的受体蛋白，NanoBRET™Assay将明亮的NanoLuc®萤光素酶用作能量供体，并将荧光基团标记的HaloTag®蛋白用作能量受体。这种灵敏的PPI检测意味着可对表达水平较低的全长蛋白进行研究。
当蛋白A和蛋白B发生相互作用时，从NanoLuc®-融合蛋白A（能量供体）到荧光标记的HaloTag®-融合蛋白B（能量受体）的能量转移的示意图。
