概述
通过使用CRISPR/Cas9基因编辑工具在内源性目标位点敲入生物发光标签，可以使用简单的光输出测量来研究由天然启动子所表达的蛋白质。与过表达模型相比，内源性标记的蛋白质与天然相互作用的伙伴蛋白质保持自然的表观遗传调控和化学计量，从而改善了检测窗口，最大限度地减少了伪影，以及在生理相关条件下可创建更准确的蛋白质生物学模型。
HiBiT是研究内源性蛋白质的常用标签。HiBiT是含有11个氨基酸的小肽，可与称为LgBiT的较大亚基以高亲和力结合。所结合的复合物具有较高的萤光素酶活性，加入底物后会产生明亮的发光信号。与较大的标签相比，小尺寸的HiBiT标签增加了基因敲入的效率，无需进行分子克隆，使其非常适合CRISPR/Cas9编辑工作流程。
Promega为流行的靶标和细胞本底提供全面的由CRISPR编辑的细胞系池和细胞系克隆选择。
采用CRISPR/Cas9将标签敲入内源性位点
结合CRISPR/Cas9基因敲入和活细胞生物发光检测方法，可以实时监测蛋白质丰度的改变，更好地理解细胞蛋白质的动态变化。
- 监测生理表达水平：无基因剂量效应
- 研究天然启动子和表观遗传调控所调控的基因
- 维持与天然相互作用的伙伴蛋白质的化学计量
CRISPR基因敲入的应用举例
1. 检测蛋白质丰度的调控
可以通过改变细胞条件自然调节细胞蛋白水平，或者作为治疗策略，有目的地操纵细胞蛋白水平。最近，靶蛋白降解已成为一种新的小分子模式，解决了以前无法成药的靶蛋白。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将生物发光标签插入内源性位点，可以定量检测蛋白质丰度，而无需使用靶标特异性抗体。这些检测方法在终点或活细胞形式下灵敏且易读，可详细分析内源性靶蛋白水平。
内源性标签改善了HIF1A丰度测定的检测窗口。将不同量的由CMV或PGK启动子驱动的Hif1a-HiBiT表达载体瞬时转染到HeLa细胞；或者，使用CRISPR/Cas9基因编辑将HiBiT标签敲入HeLa细胞的内源性位点。按照说明使用1,10-菲咯啉滴定处理细胞，并用Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent测定蛋白质丰度。
PROTAC处理的内源性HiBiT-BRD4的降解动力学。在HEK293 LgBiT细胞系的内源性BRD4位点插入HiBiT。在含有Nano-Glo® Endurazine™底物、不依赖CO2的培养基中滴定MZ1处理细胞。在GloMax® Discover酶标仪上实时测量发光信号强度。
2. 细胞表面受体的内化
通常情况下，细胞表面受体与配体结合后，受体内化，这就是细胞信号调节机制。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在受体的胞外末端插入生物发光标签，监测受体内化及其随后返回细胞表面。
化合物处理的内源性膜受体内化的定量。按照说明，用EGF处理既往使用CRISPR基因编辑技术将HiBiT插入内源性EGFR位点的HeLa细胞池。使用Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统特异性检测细胞表面表达的HiBiT-EGFR。
3. 下游靶基因的调控
通常，信号通路上游蛋白质丰度或活性的变化可调控下游靶基因的表达。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，标记内源性下游靶基因，并检测相应蛋白质的表达，以了解其对靶基因调控的影响。使用活细胞检测，实时监测下游靶标丰度。
监测上游调节蛋白质降解后的cMyc水平。MV-4-11细胞是一种急性髓性白血病模型，使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，将HiBiT插入内源性cMyc位点，共表达LgBiT。BET蛋白正调控细胞cMyc基因的表达，在失去抑制或BET家族蛋白降解后，cMyc基因表达下调。用BET蛋白降解化合物dBET1和MZ1处理细胞后，实时监测cMyc水平。BET蛋白水平的下降导致下游靶标cMyc表达减少。
如何进行CRISPR基因敲入
CRISPR基因敲入是一种简单有效的HiBiT标记法，无需进行分子克隆。从基因编辑到检测内源性生物学，只要24小时就可以完成。
CRISPR的内源性生物学实验的工作流程具体选择取决于实验类型、实验室资源和经验以及项目时间表。你可以从头到尾自行设计你的实验，也可以与Promega合作，使用我们用CRISPR编辑的细胞系池和细胞系克隆，可用的细胞系池和细胞系克隆涵盖多种靶蛋白和细胞本底。 如果你需要当前不可用的靶标或细胞系，我们的定制开发团队将很乐意为你提供帮助。
| 选项 1：自己动手(DIY) 我们可以一步步地指导你完成CRISPR基因敲入。 | 选项 2：细胞系池和细胞系克隆 我们的许可证授予客户通过权。客户不需要获得CRISPR许可证就可以使用我们的细胞系池。请参阅我们的细胞系池和细胞系克隆的综合列表，了解流行的靶标和细胞本底。
| 选项 3：定制细胞系开发 我们的检测开发和服务团队随时准备讨论你的研究需求，包括你感兴趣的靶标和首选的细胞本底。 |
CRISPR基因敲入编辑的更多应用
CRISPR基因敲入的多功能性和便利性使其应用广泛。此处使用关键示例说明。
| 靶蛋白降解 从细胞中清除选择性靶向蛋白是一种新的有前景的潜在治疗模式。 | 靶点作用 发现了可灵敏检测完整细胞中与化合物结合的选择性靶蛋白的方法。 | 蛋白质的内化和分泌 简单、灵敏和可扩展的生物发光检测法，用于定量分析 受体的内化和分泌。 |
GloMax® Discover 酶标仪
GloMax® Discover是使用Promega化学试剂开发的即用型多功能酶标仪，可简单检测发光信号、荧光信号和吸光度。该仪器可以整合到高通量工作流程中，用于CRISPR-HiBiT基因敲入细胞系的所有内源性生物学实验。
启用CRISPR/Cas9的内源性生物学资源
用CRISPR介导的标签敲入研究内源性蛋白动力学：了解你的选项 CRISPR介导的发光肽标记的内源性蛋白 HiBiT检测试剂 全面讨论敲入蛋白标签的方法，以及内源性蛋白功能的检测结果
ACS Chem. Biol.出版的文章证明了小发光肽能够有效标记内源性蛋白。此方法可灵敏定量调节表达和共价修饰的蛋白反应动力学
比较几种使用简单发光信号来检测和定量标记蛋白的方法
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