PARP和DDR通路药物发研发
DNA损伤应答（DNA damage response 简称 DDR）是一种正常的细胞功能，可激活细胞DNA修复、导致细胞周期停滞、诱导细胞衰老和/或凋亡以应答细胞DNA损伤。DDR通路缺陷可导致基因组不稳定性，诱发癌症，致使细胞增殖失控。DDR途径中的许多激酶，如WEE1、DNA PK和ATM/ATR，已被用作癌症治疗的药物靶点。聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）家族由17个成员组成，参与介导一系列细胞过程，包括基因转录和DNA修复，与人类疾病发生密切相关。
Promega提供了各种检测和技术，促进PARP/DDR通路药物的发现。包括用于检测化合物与通路组分结合的靶点结合检测、PARP和激酶活性检测以及细胞健康监测。
许多信号网络都与DDR机制有关。这些模式涉及传感器（例如PARP）、介质（例如DNA PK、ATM、ATR）以及信号传导的传导子和效应器（例如激酶）。PARP蛋白家族根据聚ADP核糖基化和单ADP核糖基化分为两组。
PARP靶点结合
NanoBRET™的领先技术可提供灵敏、特异性高的方法来测量小分子药物与其靶蛋白在活细胞中的相互作用。
使用NanoBRET™ TargetEngagement Assay，您可以：
· 量化活细胞中的化合物亲和力（与蛋白质结合的紧密程度）以及目标蛋白的占有率（与蛋白质结合的数量）。
· 评估化合物在生理条件下可以与目标蛋白结合多长时间（其滞留时间）。
· 扩展简单、多孔的检测方式可满足您的研究通量需求。
· 生成具有低错误率和高再现性的高质量数据。
· 可使用即用型检测试剂盒快速入门。
NanoBRET™ Target Engagement Assay原理
测试化合物的结合可导致完整细胞内的NanoLuc®靶向融合蛋白和细胞渗透性荧光示踪剂之间的NanoBRET™信号丢失
NanoBRET™ TE PARP Assay可用于表征PARP抑制剂对多种PARP的选择性和亲和力。细胞内滞留时间可以用一种简单的形式进行评估，即在添加示踪剂之前，添加未修饰的化合物。洗去化合物后，添加示踪剂，并对活细胞中的滞留时间进行测定。
PARP1抑制剂对于未经深入研究的PARP作用复杂
经FDA批准的临床PARP抑制剂在细胞中可结合一系列单PARP
使用NAD/NADH-Glo™ Assay检测PARP活性
DNA损伤时， PARP活性被上调。单体NAD(+)被消耗，并在损伤处经酶促聚合反应形成聚ADP核糖基化链，或将单ADP核糖添加至目标底物中。
生物发光NAD/NADH-Glo™ Assay是一种可在细胞裂解物等生物样品中，检测NAD(+)和NADH，并测定其比例的均质测定法。简单的“加样-读取”模式可适用于高通量筛选。可根据实验需求调整方案，用于测量PARP和其他酶的活性。
PARP活性检测。在384孔板中，在含有PARP1、375ng核小体和20μM NAD的反应中测量PARP1活性。经过一小时孵育后，通过添加同等体积的经修饰的NAD/NADH Glo™ Detection Reagent，分析NAD水平。20分钟后，记录发光信号。图A：滴定PARP1酶（体积：5μl）。图B：PARP1抑制。
用于测定PARP活性的AMP-Glo™ Assay
AMP-Glo™ Assay是一种从任何生成AMP的生物化学反应中产生发光信号的均质性检测。可用于检测多种酶的活性，例如环状AMP特异性磷酸二酯酶、氨酰基tRNA合成酶、DNA连接酶和泛素连接酶或由AMP调节的酶。
使用修饰的AMP-Glo™ assay测定ADP核糖基化。图A：核小体上PARP1的聚ADP核糖基化。使用50μg/ml核小体、20μM NAD + 和不同量的PARP1进行含有PARP1活性的反应，并使用AMP-Glo™系统分析。图B：利用DPQ测定PARP1抑制作用。
参见使用该测定法监测聚ADP核糖基化的文献：
Mondal, S., Hsiao, K. and Goueli, S.A. (2017) Utility of Adenosine Monophosphate Detection System for Monitoring theActivities of Diverse Enzyme Reactions. ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies 15, 300–341.
DDR中的激酶
利用ADP-Glo™ Assay分析激酶选择性
ADP-Glo™ Kinase Assay是一种适用于所有激酶研究的通用体外生化测定法。该检测可测定激酶反应中生成的ADP。ADP可转化为ATP，可用于生成稳定的发光信号。
ADP-Glo™ Assay的适用范围包括：
· 高通量筛选
· 反应模式研究
· 激酶抑制剂分析
经过优化的Kinase Enzyme System可与ADP-Glo™ Assay共同使用，便于筛选和分析激酶抑制剂。与DNA损伤应答相关的激酶如下：
· DNA-PK · CDK6/Cyclin D3 · CHK1 · PLK-家族 · CHK2 · CK2α亚型 · CDK2/Cyclin A1 · MAPKAPK2(MK2) · CDK2/Cyclin E1 · MARK3
活细胞靶点结合
NanoBRET™ Target Engagement (TE) Kinase Assays可用于定量检测活细胞内化合物与全长激酶的结合。该检测可对340多种激酶，包括许多参与DDR的激酶（例如，CHK1、CHK2、CDK2/Cycin A1、CDK2/Cyclin E1、CDK6/Cycin D、PKMYT1、PLK家族、CK2α亚型、MAPKAPK2（MK2）、MARK3、Wee1）。每个激酶都有单独的使用说明。查看Kinase Target Engagement Assay Selection Guide，了解可用激酶的完整列表。
无细胞与活细胞内分析方法相比，DDR激酶抑制剂选择性
总的或磷酸化的细胞靶标测定
使用Lumit™ Immunoassay Cellular Systems研究DNA损伤应答中的信号节点
Lumit™ Immunoassay Cellular System是一种无需洗涤的生物发光免疫分析，可直接测量细胞裂解物中的目标分析物。该分析可以定制，以检测参与DNA损伤反应的信号节点，使用简单的工作流程，不需要培养液移除或裂解物转移。只需将标记抗体添加至样本中，添加检测试剂，读取发光信号——所有步骤都在同一块检测板中完成。
细胞活性检测
测定细胞活性和细胞毒性
我们提供了多种检测组合用于测定细胞活性。这些可自动化的、实时的或终点的分析方法都可使用简单的“加样-混合-读取”模式，是二次筛选和先导物优化的理想选择。可测定候选药物对活细胞（包括3D培养中的细胞）的细胞健康和细胞毒性的影响。
CellTiter Glo®2.0 Cell Viability Assay是一种高灵敏度的检测，具有广泛的线性范围。可用于384孔板和1536孔板，进行高通量初次筛选使用。
关于这些细胞健康测定应用于DDR的方法，可参见下列文献。
参考文献：
· Zimmermann, M. et al. (2022) Guiding ATR and PARPinhibitor combinations with chemogenomic screens.Cell Reports.40,111081.
· Kim, C. et al. (2020) PARP1 inhibitors triggerinnate immunity via PARP1 trapping induced DNA damage response.eLifeAugust 26, e60637.
· Blessing, C. et al. (2020) The oncogenic helicaseALC1 regulates PARP inhibitor potency by trapping PARP2 at DNA breaks.Mol. Cell.80, 862–875.
分析服务
我们的定制检测服务可协助您推进小分子和大分子药物发现和开发流程。基于我们的技术，我们可提供综合性服务，用于获得高灵敏度、高通量的生物相关结果。更多相关信息，请联系定制研发解决方案团队。
PARP化合物选择性分析服务
· 使用NanoBRET™TE检测对12个PARP家族成员进行活细胞选择性分析
· BRET比率数据具有再现性，错误率较低
激酶细胞选择性化合物分析服务
· 使用NanoBRET™TE检测对240个激酶进行活细胞选择性分析
· BRET比率数据具有再现性，错误率较低
