引言
除了需要快速开发检测SARS-CoV-2和鉴定受感染个体的检测方法外，COVID-19危机还引起全球范围内针对SARS-CoV-2的药物治疗和疫苗的大力开发。另外，对SARS-CoV-2病毒的生物学特性有更全面的了解也非常重要。我们支持致力于疫苗开发并探究有关病毒病理学和治疗问题的科学家们，这些待探究的问题通常包括：
- 病毒如何进入人体细胞？
- 该病毒如何使人生病？
- 可以使用哪些疗法来减轻症状？
- 如何获得对病毒的免疫力？
我们提供合作支持以及广泛的试剂组合，这些试剂可在研究冠状病毒和其他新兴病毒性疾病的研究实验室中得到应用。
跟踪和监测细胞中的病毒活性
了解病毒病原体与宿主细胞之间的相互作用，以及监测病毒活性对细胞的影响，对于开发有效的抗病毒治疗或疫苗至关重要。Promega的技术可用于监测病毒发病机理中关键步骤的研究，包括检测病毒与宿主细胞表面受体的相互作用，跟踪和监测细胞内病毒核酸和蛋白质的产生以及监测宿主细胞的活力和代谢。
检测病毒:宿主蛋白:蛋白的相互作用
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了解SARS-CoV-2病毒如何进入宿主细胞是开发治疗药物/方法或预防感染的潜在的第一步。病毒进入细胞的过程取决于宿主细胞表面受体与病毒蛋白之间的蛋白:蛋白相互作用。蛋白:蛋白相互作用检测系统是研究这些相互作用的极有价值的工具。
NanoBiT®和NanoBRET™技术提供了在体内表达的浓度下检测蛋白：蛋白相互作用所需要的灵敏度。两者都是基于生物发光的方法，由于所用的萤光素酶很小且信号明亮，因此在病毒研究中特别有用。如想了解更详细的信息，请参阅下面列出的参考资料和资源。
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病毒研究中的蛋白相互作用
参考文献
| 病毒研究中的蛋白相互作用 Rawle, D.J., et al. (2018) HIV-1 uncoating and reverse transcription require eEF1A binding to surface-exposed acidic residues of the reverse transcriptase thumb domain. mBio 9, e00316-18. Miyakawa, K., et al. (2017) The tumour suppressor APC promotes HIV-1 assembly via interaction with Gag precursor protein. Nature Comm. 8, 14259. |
| NanoBRET技术介绍 Machleidt, T., et al. (2015) NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interaction. ACS Chem. Biol. 10, 1797-804. |
| NanoBiT技术介绍 Dixon, A.S., et al. (2016) NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem. Biol. 11, 400-8. |
跟踪重组病毒并检测报告基因活性
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萤光素酶报告基因提供了一种简单方便的方法，用于监测潜在治疗的效果，既可以创建体外检测病毒抗体的方法，又可以建立对动物模型中的病毒进行成像的方法。小身材的NanoLuc®萤光素酶对于构建病毒报告载体特别有用。 其他报告基因，包括萤火虫和海肾萤光素酶，经常被用于假型病毒的构建。假型病毒颗粒是通过用另一种病毒的宿主结合蛋白代替其宿主结合蛋白并添加遗传报告基因而构建成的，从而使研究人员能够研究病毒侵入的过程。假型病毒也可用于研究病毒的抑制剂，例如抗体和小分子化合物。
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萤光素酶报告基因检测系统
Nano-Glo® 萤光素酶报告基因检测系统 | Nano-Glo® Live Cell Assay（Nano-Glo®活细胞检测系统） |
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参考文献
使用报告基因检测的假病毒研究Millet, J.K., et al. (2019) Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting. J. Vis. Exp. (145), e59010. |
| 使用假病毒研究受体结合 Walls, A.C., et al. (2020) Structure, function and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell online 9 March 2020. |
| 综述 Andersen, P.I. (2020) Discovery and development of safe-in-man broad-spectrum antiviral agents. Int. J. Inf. Dis. 93, 268-75. |
小型、明亮的萤光素酶报告基因的优势
重组报告病毒是增进我们对细胞和动物模型中病毒生命周期和杀伤力的了解的重要工具。重组报告病毒使随着时间的推移追踪同一只动物的感染并量化诸如细胞进入和复制等事件更容易。
将大的报告基因（例如萤火虫萤光素酶）插入基因组常会在病毒加工过程中导致缺陷。由于NanoLuc®和HiBiT标签很小，因此可以稳定地插入病毒基因组，而不会破坏病毒天然的生物学特性。
检测和监控病毒拷贝数
| 基于PCR的方法，例如终点法和实时定量PCR和RT-PCR，是开发病毒检测试验以及分析病毒基因组的基本工具。 GoTaq® PCR和qPCR系统以及GoScript™逆转录酶可为检测和扩增众多病毒靶标序列提供可靠且可重复的扩增和逆转录。 GoTaq® 1-StepRT-qPCR系统已被批准可与美国CDC制定的操作流程一起用于SARS-CoV-2检测。PCR Master Mix也已被应用于SARS-CoV-2 PCR诊断测试的开发中。 |
CDCSARS-CoV-2测试操作步骤
可选择GoTaq® 1-Step Probe系统与美国CDC的Novel CoronavirusReal-Time RT-PCR Diagnostic Panel一起使用。
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CDCSARS-CoV-2测试操作步骤
可选择GoTaq® 1-Step Probe系统与美国CDC的Novel CoronavirusReal-Time RT-PCR Diagnostic Panel一起使用。
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PCR、qPCR和RT-PCR试剂
A6101, A6102, A6120, A6121, A6110
GoTaq® Probe qPCR and RT-qPCR Systems
PCR优化试剂盒
GoScript™ 逆转录酶
参考文献
GoTaq® 1-Step RT-qPCR System
Nelson, A.C. et al. (2020) Analytical Validation of a COVID-19 qRT-PCR Detection AssayUsing a 384-well Format and Three Extraction Methods. doi:https://doi.org/10.1101/2020.04.02.022186
Driouich, J.-S., et al. (2018) SuPReMe:A rapid reverse genetics method to generate clonal populations of recombinantRNA viruses. Emerg. Microb. Infect. 7, 40
用qPCR检测病毒RNA
Cai, M. et al. (2020) The R251KSubstitution in Viral Protein PB2 Increases Viral Replication and Pathogenicityof Eurasian Avian-like H1N1 Swine Influenza Viruses. Viruses 12(1),52.
Si,L., et al. (2020) Human organs-on-chips as tools for repurposing approved drugsas potential influenza and COVID19 therapeutics in viral pandemics.BioRxiv, April 2020. DOI: https://doi.org/10.1101/2020.04.13.039917
病毒结构与表征研究
Wicht, O. et al. (2014) ProteolyticActivation of the Porcine Epidemic Diarrhea Coronavirus Spike Fusion Protein byTrypsin in Cell Culture. J. Virol. 88(14), 7952–7961.
监测宿主细胞功能
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监测化合物的抗病毒活性包括测试宿主细胞中病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。适用于高通量分析的细胞活力检测（例如CellTiter-Glo®）对于一次测试数百或数千种化合物非常有用，可减少分析潜在治疗效果所需的时间。细胞活力检测也可用于支持病毒作用机理的研究。
除细胞病变效应外，病毒感染还会引起细胞代谢的改变。在许多传染性疾病中，病毒会重新编程宿主细胞的新陈代谢以支持病毒复制。可以通过监测营养物吸收和辅因子（例如NADPH）变化的检测来了解这些病毒诱导的代谢变化。
通过质谱表征蛋白质是用于监测病毒诱导的宿主细胞变化的另一种方法。分析细胞蛋白质的变化有助于科研人员了解病毒如何与细胞通路相互作用。 |
细胞活力、代谢和蛋白质组学研究的解决方案
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Glucose-Glo™ Assay |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade |
| 使用细胞活力检测来评估SARS-CoV-2抑制剂 Hoffman, M., et al. (2020) SARS-CoV-2 Cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell online 5 Mar 2020. Sheahan, T. et al. (2020) An orally bioavailable broad-spectrum antiviral inhibits SARS-CoV-2 and mutlipe endemic, epidemic and bat coronavirus BioRxIV March 2020. |
| SARS-CoV-2代谢影响概述 Bornstein, S. et al. (2020) Endocrine and metabolic link to coronavirus infection. Nat. Rev. Endocrinol. https://www.nature.com/articles/ s41574-020-0353-9 |
| SARS-CoV-2感染中的蛋白质组学 Bojkova, D. et al. (2020)SARS-CoV-2 infected host cell proteomics reveal potential therapy targets. DOI: 10.21203/rs.3.rs-17218/v1 Accessed April 17, 2020. |
相关资源
确定病毒诱导的CPE（细胞病变效应）
监控免疫应答
| 病毒研究人员提出的一个关键问题是宿主的免疫系统如何应对病毒感染，包括适应性免疫和先天性免疫。先天性的免疫应答涉及炎症小体（inflammasome）的激活和细胞因子的释放。虽然这种细胞因子释放具有治疗作用，但“细胞因子风暴”可能给患者带来不良副作用，必须采用旨在阻断释放的细胞因子（例如IL-6和IL-15）功效的其他治疗药物来应对。 除先天性免疫应答外，体液和细胞应答在宿主应答中也起着关键作用。这些问题可以通过报告基因生物检测（reporter bioassay）系统以及在基于细胞的研究应用中检测caspase-1活性和细胞因子水平的检测系统来回答。 |
Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay
ADCC Reporter Bioassays, V VariantG7015, G7014, G7010, G7016, G7013, G7018 |
IL-6 Bioassay |
参考文献
病毒感染中的炎性小体活化
Soderholm, S. et al.(2016) Phosphoproteomics to Characterize Host Response DuringInfluenza A Virus Infection of Human Macrophages (2016) Molecular& Cellular Proteomics 15(10), 3203–3219.
SARS-CoV-2感染中的炎性小体激活
Conti P. et al. (2020) Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) andlung inflammation by Coronavirus-19 (CoV-19 or SARS-CoV-2): anti-inflammatorystrategies. J. Biol. Regul. Homeost. Agents Mar 14; 34(2) doi:10.23812/CONTI-E [Epub ahead of print].
使用报告基因生物检测法研究中和抗体
相关资源
产品：利用Lumit™免疫检测系统进行细胞因子检测
合成RNA用于疫苗研发
转录出的RNA是疫苗生产、病毒标准品和基础病毒研究所必需的。对于体内和体外研究而言，RiboMAX® RNA Production System可从DNA模板中生成大量高质量的RNA或mRNA，而无需哺乳动物细胞或细胞成分。这些体外转录合成的病毒RNA或mRNA转录本，通常编码疾病特异性抗原（例如冠状病毒的棘突蛋白【spike protein】），可用作病毒感染研究的接种材料。如果要将转录合成的mRNA用作治疗剂，则可根据需要包装编码所需蛋白质的mRNA，以递送至靶标组织。
T7 RiboMAX™ Express Large-Scale RNA Production System
T7 RiboMAX™ Express Large-Scale RNA Production System
参考文献
生成冠状病毒RNA
Eriksson K.K., et al. (2008) Generation of Recombinant Coronaviruses Using Vaccinia Virus as the Cloning Vector and Stable Cell Lines Containing Coronaviral Replicon RNAs. In: Cavanagh D. (eds) SARS- and Other Coronaviruses. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 454. Humana Press, Totowa, NJ.
RNA制备
Ding X., et al. (2020) All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-Cov-2 and HIV virus. BioRxiv accessed April 13 2020. doi.org/10.1101/2020.03.19.998724
使用RiboMAX合成RNA标准品
Xu, L. et al. (2009) Evaluation of Sensitivities and Specificities of SARS-CoV Detection by Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays. Virologica Sinica, 24 (3), 187-193. DOI 10.1007/s12250-009-3021-8
生物发光检测
Promega用于病毒研究的试剂使用生物发光技术，因而使这些检测系统高度灵敏且易于使用。GloMax®读板仪带有预装的操作方案，使Promega发光检测的读数和对结果的解读更加简单。
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