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应用数据 | 全流程FcγR检测方案，助力抗CD20生物类似药开发
从结合到桥接：
完整的FcγR检测方案工具加速抗体疗法开发
治疗性抗体和Fc融合蛋白因其能够高特异性结合抗原，并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)等效应功能激活免疫反应，从而对多种疾病有效。当抗体的Fc结构域与自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫效应细胞表面的Fcγ受体相互作用时，便会触发这些效应功能。然而，表征这些相互作用的传统方法存在变异性大且耗时费力的问题。
为满足对可靠、易用检测方法的需求，Promega开发了一套全面的生物发光检测方案，遵循ICH指南，旨在稳健、高效地测量抗体研发全流程中的效应功能，包括：
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Lumit® FcγR结合免疫检测
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Lumit® C1q结合检测
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用于ADCC和ADCP的Fc效应子报告基因生物检测
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使用经作用机制验证的原代细胞的HiBiT靶细胞杀伤生物检测
本文将通过一组数据，展示如何利用这些检测方案，在生物类似药抗体开发的背景下，表征抗CD20抗体。通过这些解决方案，我们致力于为从早期发现到商业化生产及批次放行的抗体研发全流程研究人员提供支持。
数据展示：
Lumit® FcγR结合免疫检测
01
检测原理及工作流程
Lumit® FcγR 结合免疫检测是基于 NanoBiT® 蛋白互补技术的竞争性免疫检测方法。
02
Lumit® FcγRI, FcγRIIb, 与 FcγRIIIb 结合免疫检测
Lumit® FcγR 结合免疫检测法适用于根据不同IgG亚型对各种FcγR的亲和力对其进行排序，非常适用于生物类似药结合动力学的筛选。
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FcγRI 是表达于吞噬细胞和抗原呈递细胞表面的IgG Fc段高亲和力受体，它介导 IgG 依赖性吞噬作用及抗体驱动的效应功能。
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FcγRIIb 是唯一具有抑制功能的 Fcγ 受体，表达于 B 细胞和髓系细胞，通过结合 IgG 免疫复合物来抑制免疫细胞的活化。
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FcγRIIIb 是一种低亲和力的 Fcγ 受体，主要表达于中性粒细胞，通过结合 IgG 免疫复合物来促进其清除，并触发中性粒细胞的活化与脱颗粒。
03
Lumit® 结合免疫检测法适用于生物类似药筛选
Lumit® FcγR 结合免疫检测法可用于区分两种已上市的抗 CD20 生物类似药在结合特性上的差异。
Lumit® FcγR结合免疫检测可在60分钟内提供亚型特异性结合和亲和力排序，无固定化假象，适用于高通量初筛（96-384孔板）或作为SPR/BLI的正交确认方法。
数据展示：
Lumit® C1q结合检测
01
Lumit® C1q 结合检测法可精准检测不同抗体变体间的结合差异
Lumit® C1q 结合检测法的原理：该检测基于分裂萤光素酶技术。一半萤光素酶（LgBiT）与C1q结合，另一半（SmBiT）与抗 IgG Fab 示踪剂结合。只有当待测抗体将标记的C1q和抗IgG Fab示踪分子拉近至邻近位置，从而形成有活性的NanoBiT®萤光素酶时，才会产生发光信号。
Lumit® C1q 结合检测法适用于区分抗体的特异性与灵敏度。该检测已针对一组利妥昔单抗（Rituximab）变体进行了测试，这些变体包含不同的 IgG 亚型以及岩藻糖基化和糖基化修饰。检测所得的结合谱与已发表文献一致。
数据展示：
Fc效应子报告基因生物检测
01
检测原理与工作流程
检测原理：Fc效应子生物检测法包含两种细胞系——靶细胞和报告基因细胞。当与IgG抗体共培养时，FcγR被激活并触发启动子驱动的发光反应，该信号使用Bio-Glo™萤光素酶检测系统进行检测。
02
FcγR报告基因检测法用于测定抗体效价
ADCC报告基因生物检测法反映了旨在结合并激活FcγRIIIa的抗体的作用机制和特异性，同时展现出恰当的亚型特异性。单个FcγR在报告细胞中表达。
(A) FcγRIIIa (V158) Bioassay
(B) FcγRIIIa (F158) Bioassay
FcγRIIa ADCP 报告基因生物检测法反映了旨在结合并激活 FcγRIIa 的抗体的作用机制和特异性。上述数据展示了在 Raji 靶细胞存在下使用抗 CD20 抗体的结果。
(C) FcγRIIa (H131) ADCP Bioassay
(D) FcγRIIa (R131) ADCP Bioassay
Fc效应子报告基因生物检测使用即融即用的表达人源单个FcγR的细胞系；其符合ICH标准的精密度、准确性和线性范围，可识别导致功能效价变化的结合差异。
数据展示：
HiBiT靶细胞杀伤生物检测
01
原理及工作流程
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效应细胞与表达HiBiT的靶细胞共孵育后，会引发肿瘤相关抗原 (TAA) 依赖的靶细胞裂解，并释放 HiBiT 至培养基中。
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HiBiT与Bio-Glo-NB™ TCK 检测试剂中细胞不可渗透的LgBiT 结合，形成有功能的NanoBiT® 萤光素酶并发光。
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该技术可实现基于作用机制的、快速的生物制剂和细胞治疗产品的效价测试。
02
HiBiT TCK 平台用于测量生物类似药桥接研究中的靶细胞杀伤作用
HiBiT TCK 生物检测法反映了生物药物的 ADCC 作用机制。所示抗 CD20 生物类似药与人外周血单个核细胞（经 ADCC 验证的效应细胞）共孵育，或在 ADCC 生物检测中与系列稀释的指定抗体共同作用。
HiBiT靶细胞杀伤检测通过靶细胞的NanoBiT®发光信号，关联到真实原代PBMC或CD8⁺ T细胞的活性，提供无需洗涤的定量细胞毒性读数，从而将结合数据和报告基因效价数据与生理性细胞杀伤作用相衔接——是桥接和可比性研究的理想选择。
总结
从结合到功能的完整检测体系——一套集成的Lumit® FcγR结合检测、Fc效应子报告基因检测和HiBiT靶细胞杀伤（TCK）检测方案，提供了从初始筛选到批次放行（lot release）的抗体Fc效应活性追踪的一贯工作流程。
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跨层级数据一致性——在多种抗CD20变体中，Lumit®检测得到的IC50值排序与报告基因法EC50值及靶细胞杀伤实验中观察到的裂解效力排序保持一致，这证实了该方法对下游细胞毒性的预测能力。
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时间与风险削减——统一的板式布局设计与检测质量控制，将方法转移时间从数周缩短至数天，并消除了不同检测间的结果校准步骤，从而支持加速新药临床试验申请（IND）和生物制品许可申请（BLA）的提交进程。
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符合法规的设计——所有检测方法均依据ICH指南开发，包含系统适用性对照、明确的验收标准及批次专用合格证书（CoAs），便于纳入可比性研究、稳定性考察与产品放行方案。
