NAFLD和NASH肝脏疾病
研究工具汇总
肝脏疾病例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是没有有效治疗方法的慢性疾病。为了支持研究人员对肝脏疾病的研究，Promega提供简单、可靠的方法来测量细胞代谢、氧化应激和炎症。我们的检测方法使用了生物发光技术，检测灵敏度高，操作快速且简单。
Promega肝病研究检测方法优势：
1. 兼容多种样本类型保证项目的连续性——包括简单的细胞模型到复杂的 3D 类器官和组织样本。
2. 发光法检测灵敏度高，可以精确监测生物的变化。
3. 更宽的线性范围可以检测代谢物浓度的 1,000 倍变化，无需任何样品稀释。
4. 微孔板形式允许采用高通量快速筛选抑制剂。
检测产品包括：包括甘油、甘油三酯、胆固醇/胆固醇酯、葡萄糖摄取、糖原合成、氧化应激、细胞死亡、炎性等。
01
什么是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)?
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一个概括的说法，主要是肝脏中的脂肪(包括甘油三酯、游离脂肪酸和胆固醇)过度积累导致的一系列情况。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)有两种类型：
1. 非酒精性脂肪肝(NAFL)，其肝脏几乎没有炎症；
2. 非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其特点是脂肪积聚并伴有炎症和肝脏损伤。如果患者未被确诊为NAFLD，而疾病继续发展最终可能会发展为肝纤维化、肝硬化和原发性肝癌。
NAFLD比较常见，全世界25%以上的成年人都受其影响。然而，目前还没有FDA批准的治疗药物。这种疾病比较复杂，许多环境和遗传因素与疾病的起源和发展有关。更复杂的是，因为肝脏是许多代谢途径的中心，这种疾病的病理是系统性的。因此，监测代谢途径和细胞健康的检测方法对于提高我们对NAFLD的认识和开发该病的治疗方法非常重要。
实验：HepG2细胞作为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的研究模型
上图.每孔培养20,000个HepG2细胞在含有或不含0.3mM BSA结合的亚油酸和油酸的情况下过夜孵育，以诱导脂肪变性。用PBS洗涤细胞后，用Triglyceride-Glo™ Assay检测。
实验：肝微球体作为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）研究的模型
上图. 将1500个人肝细胞接种在圆形底96孔超低吸附板中，加入200μl平板培养基，5天后形成微球体。在含有或不含0.3 mM BSA结合的亚油酸和油酸的情况下，用维持液（含少量胰岛素，10 nM）培养2周，以诱导脂肪变性。每3-4天取出100 μl培养基，用100 μl PBS冲洗，加入100 μl的2倍维持液。在检测之前，用100μl PBS清洗微球体4次，尽量减少细胞外的甘油。
02
如何检测甘油三酯稳态和脂肪变性？
NAFLD的标志性病理是肝细胞内甘油三酯的积累，也称为脂肪变性。过量的甘油三酯主要有两个来源：
1. 饮食和脂肪组织中的游离脂肪酸(FFA)通过脂肪合成转化为甘油三酯。
2. 胰岛素抵抗作用促进脂肪从头生成，即由碳水化合物生成甘油三酯。
Triglyceride-Glo™ Assay（甘油三酯检测试剂盒）助您轻松检测脂肪变性和脂肪生成。该试剂盒：
1. 适用于多种样品类型，包括细胞裂解物、培养基、组织匀浆、血清和脂蛋白组分。
2. 采用生物发光法检测，与基于多孔板的染色法、比色法或荧光法相比，操作简单、无需清洗且灵敏度高。
3. 不采用繁琐的有机萃取，而是采用一种快速洗涤溶解步骤制备脂质样品。
同样，Glycerol-Glo™ Assay（甘油检测试剂盒）也可以用来测量脂肪分解中产生的甘油。
实验：人肝脏微组织中的甘油三酯水平检测
上图. 将3D InSight™人肝微组织（MT，InSphero，〜1150个细胞/孔）在无血清培养基中孵育3天和10天，培养基含有生理（LG/LI）或超生理（LG/HI）水平的葡萄糖和胰岛素，以及与BSA结合的游离脂肪酸（FFA）或低密度脂蛋白血浆组分（LDL）。将微组织在PBS中洗涤两次，并根据标准操作方法检测总甘油浓度，将数值绘制为每个微组织（MT）中甘油三酯的浓度。数据由瑞士苏黎世的InSphero公司提供。
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应用研究：在NASH细胞模型中评估药物诱导毒性。
Kermanizadeh等人的研究中表明，预先存在的疾病在外来生物诱导的肝损伤加剧中至关重要。他们使用Triglyceride-Glo™Assay监测3D人类肝脏组织中的脂质积累，同时使用CellTiter-Glo®2.0监测细胞活力。
03
如何检测葡萄糖代谢？
有研究表明，脂肪肝的肝细胞中糖酵解过程会发生变化，包括糖酵解、乳酸生成和糖异生过程增加。NAFLD肝脏中的胰岛素抵抗会导致这种代谢失调。我们提供一系列的分析方法，帮助您灵敏的检测葡萄糖代谢变化。
糖异生：
即新的葡萄糖分子的合成，可以使用Glucose-Glo™ Assay检测。
实验：iPSC人肝脏微球体中胰岛素介导的糖异生抑制
上图. 用iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics)制备人肝脏微球体。将细胞解冻并加入胶原培养5天，然后调整细胞数量大约为2000个细胞/孔并置于GravityTRAP™96孔微球板(Insphero)中。实验当天，将培养基移出，细胞在糖异生培养基中孵育1.5小时，以抑制糖酵解并促进肝脏葡萄糖生成。然后，在糖异生培养基中添加不同浓度的胰岛素以抑制葡萄糖生成，在该培养基中分别培养微球体6小时。6小时后，每孔取25μl培养基至96孔板，使用Glucose-Glo™ Assay （蓝色圆圈）定量检测葡萄糖。当对细胞裂解物进行葡萄糖检测时，也得到了类似的结果（绿色方块）。
糖酵解：
即葡萄糖分解转化为能量，可以使用Glucose-Glo™ Assays和Lactate-Glo™ Assays检测。
糖原合成和分解：
使用Glycogen-Glo™ Assay检测。
葡萄糖摄取速率：
使用Glucose Uptake-Glo™ Assay检测。
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应用研究：了解二甲双胍（Metformin）的抗癌作用
Cai等人发现二甲双胍有益于降低HepG2细胞化疗耐药性，有助于改善肝癌化疗。他们使用一系列Promega分析方法(Glucose Uptake-Glo™, Glucose-Glo™, Lactate-Glo™ 和NADP/NADPH-Glo™ Assays)来检测HepG2肝细胞癌细胞中的糖酵解。
04
如何检测胆固醇和脂蛋白？
NAFLD与肝脏胆固醇升高和脂蛋白产生变化有关。Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay（胆固醇/胆固醇酯检测试剂盒）可用于量化总胆固醇水平、游离胆固醇水平和胆固醇酯水平。该方案操作简单并且与细胞裂解物、组织、培养基、血清样本和脂蛋白兼容。
当肝脏中FFA过多时，极低密度脂蛋白(VLDL)被用来将FFA输出到脂肪组织。因此，NAFLD患者血清中低密度脂蛋白(LDL和VLDL)升高，高密度脂蛋白(HDL)降低。
实验：使用单一胆固醇标准品检测人脂蛋白中的胆固醇
上图. 人高密度脂蛋白（HDL，10mg/ml）和人低密度脂蛋白（LDL，5mg/ml）均来自 Kalen Biomedical。将 HDL 和 LDL 样品分别以 250 倍和 500 倍稀释于 Cholesterol Lysis Solution 中，然后根据含和不含酯酶的检测操作方法对 50µl 试液进行检测。Cholesterol Lysis Solution 中的 40µM 和 0µM 胆固醇分别被用作标准品和背景对照进行检测。RLU 值（以百万为单位）列于每栏的顶部。
05
如何检测氧化应激和细胞死亡？
氧化应激是NAFLD进展的重要贡献者。肝脏脂肪变性导致线粒体功能障碍、内质网应激和脂肪毒性，所有这些都有助于过量活性氧(ROS)的产生。ROS的积累是有害的，可导致细胞损伤、死亡和肝纤维化。过度的ROS积累最终会导致细胞死亡，这是NAFLD/NASH发病的另一个关键过程。ROS-Glo™ H2O2 Assay可以用来检测细胞中的氧化应激水平。它使用高灵敏度的生物发光发，无需清洗可以快速检测H2O2。
实验：通过使用ROS-Glo™和CellTox™ Cytotoxicity Assay对HepG2细胞中氧化应激和细胞死亡进行多重检测
上图. HepG2 细胞用产生 ROS 的化合物 ( 甲萘醌 或邻苯三酚 ) 或细胞毒性诱导试剂 ( 洋地黄皂苷 ) 处 理，37℃孵育 2 小时。细胞毒性检测试剂 CellTox™ Green 染料和 H2O2 底 物 在 给 药 的 时 候 添 加。CellTox™ Green 染料孵育后测定荧光。然后加入 ROS-Glo™ 检测液，孵育 20 分钟后，测定发光信号。
06
如何检测炎症细胞因子？
氧化应激会促进肝脏慢性炎症的发生，包括促炎细胞因子的释放。细胞因子传统是用ELISA检测的，它通常需要多次清洗步骤，花费时间较长。我们提供一种ELISA的替代方案: Lumit™ Immunoassays，操作简单，没有洗涤步骤，检测快速。它们在细胞样品中直接检测包括TNF-a、IL-1β、IL-6、HMGB1等细胞因子和其他许多你感兴趣的分子的释放。
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