qPCR实验课堂
Promega MDx classroom-qPCR
实时荧光定量PCR（ Real-Time qPCR）是分子诊断最经典的一种方法，也是ProDx 女性生殖健康系列检测产品所使用的技术。它无疑是分子诊断实验者的必备技能！这里Promega分子诊断为您轻松解锁qPCR实验技术！
在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
视频讲解：
qPCR介绍-Introduction to qPCR
专业英语Tips
模板 template ，序列 sequence
检测 detect， 灵敏 sensitive
目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，还包括：
● 基因扩增
● 扩增特异性分析
● 基因定量分析
● 基因检测
● 基因分型
● SNP分析
● RFLP多态性分析
● 单/多基因表达研究
● 高通量基因表达谱研究
……
染料法
荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。
常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。
Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.
探针法
在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
下表对两种方法进行对比：
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染料法 |
探针法 |
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标签 |
dsDNA结合的染料 |
荧光标记探针 |
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仪器 |
所有qPCR仪器 |
探针需与过滤片匹配 |
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特异性 |
检测所有dsDNA |
检测探针标记的序列 |
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复杂性 |
否 |
是，不同染料/滤光片 |
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特异性溶解曲线 |
有 |
不需要 |
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通量 |
高 |
极高 |
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样品需求量 |
低 |
极低 |
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是否需要验证 |
是 |
是 |
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应用 |
基因表达定量、 DNA定量、 染色质免疫共沉淀 |
基因表达定量、 DNA定量、染色质免疫共沉淀、数字PCR、途径分析、体细胞突变检测、拷贝数、SNP 基因分型、 mricroRNA |
视频讲解：
染料法vs探针法-qPCR:Dye vs Probe
实验室小工具
专业英语Tips
溶解曲线 melt curve ， 变性 denature
报告分子reporter ，猝灭剂 quencher
提取RNA ——RT-PCR ——以cDNA为模板检测
Real-Time qPCR MasterMix一般为预混液，只需要加入模板和引物就可以。在操作过程中，还需要根据所用Master Mix、模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
参比染料（reference dye）的作用是校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。
由于进行qPCR前需要将RNA反转录为cDNA，因此可以根据实验选择1步法（RT-PCR和qPCR在同一管中进行）或2步法（RT-PCR和qPCR分开进行）。
下表为大家总结了两种方法如何选择及优势：
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如何选择 |
优势 |
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1步法RT-qPCR |
● 无需储存cDNA ● 样本量多，只需扩增少数几个目的片段 |
● 操作过程中交叉污染的风险更低 ● 快速获得数据 |
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2步法RT-qPCR |
● 需要储存cDNA ● 每个样本要扩增多个目的片段 |
● 可以优化RT 和PCR 反应的步骤 ● cDNA 可以用于扩增许多不同的目的片段 |
视频讲解：
一步法vs两步法-1step vs 2step
实验室小工具
GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System
GoTaq® Probe 2-Step RT-qPCR System
专业英语Tips
逆转录酶 reverse transcriptase
热循环 thermal cycling
基线(baseline)：通常是3-15个循环的荧光信号
阈值(threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35
Rn(Normalized reporter)：荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果
qPCR定量方法
绝对定量和相对定量的区别在于，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。
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ProDx 分子诊断产品 2015年起，Promega向中国市场推出ProDx系列分子诊断产品，现拿到NMPA注册证的有5个产品： |
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目录号 |
产品 |
规格 |
注册证号 |
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MD1060 |
单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ型核酸分型检测试剂盒 |
48人份/盒 |
国械注准20143401933 |
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MD1070 |
高危型人乳头瘤病毒(14个型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) |
48人份/盒 |
国械注准20143401932 |
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MD1090 |
沙眼衣原体/淋球菌/解脲脲原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) |
48人份/盒 |
国械注准20143401934 |
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MD2070 |
高危型人乳头瘤病毒（14个型）核酸分型检测试剂盒 |
24人份/盒 |
国械注准20193400855 |
Promega基于完全自主生产的核心原料产品质量优势，在Promega 上海生产基地( 上海普洛麦格生物产品有限公司) 研发生产了单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ型核酸分型检测试剂盒，以及沙眼衣原体/淋球菌/解脲脲原体核酸三联检试剂盒和HPV分型检测试剂盒。采用高灵敏度的实时荧光定量PCR 方法（qPCR），对人尿道、生殖道分泌物拭子样本中的常见生殖道病原体进行核酸定性检测，可实现一次标本采样、一次检测实验、多项检测结果的快速精准联合检测的突出优势，推动《共识》建议在临床的有效应用，降低子宫颈癌或癌前病变等生殖道疾病的发病率。
ABOUT PROMEGA
Promega Corporation，简称Promega 公司，是为生命科学产业提供创新型解决方案和技术支持的领导者。Promega成立于1978 年，总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16 个国家设有分公司，在全球范围内通过经销商服务超过100个国家。公司拥有4,000 多种产品，致力于提高全球范围内的科学家对基因组学、蛋白分析和表达、细胞分析、药物研发、分子诊断和遗传鉴定等领域的认知。
Promega 在多个重要领域拥有重要的知识产权和许可，包括：
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生物发光，包括基因工程改造的萤光素酶、萤光素酶载体和底物。
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短串联重复(STR) 分析用于基于STR 分析的细胞系鉴定、人类遗传鉴定、细胞和组织鉴定及混合样本检测。
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HaloTag® 蛋白标记和捕获技术。
Promega公司是第一家进入中国的外国生物技术企业，在中国的分公司为普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即Promega (Beijing) Biotech Co.,Ltd，目前办公室位于北京。中国分公司拥有专业的销售,市场, 技术支持与物流团队及完善的流程，并以为客户提供最专业的生物技术工具与服务为己任，在中国目前主要通过经销商渠道进行销售。
