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来源: 发布时间:2023/6/30 16:15:00

HiBiT:用于评估基于MOA的CAR-T细胞效价的微小标签

1. NanoBiT®技术可实现新型靶细胞杀伤检测

● 效应细胞和表达HiBiT的靶细胞共孵育可导致靶细胞的肿瘤相关抗原(TAA)依赖性裂解和HiBiT释放至培养基中;

● HiBiT可与HiBiT检测试剂中的非细胞渗透性LgBiT进行结合,从而形成功能性NanoBiT®萤光素酶并发光;

● 能够实现对双特异性T细胞衔接系统(BiTE)和细胞治疗产品进行基于MOA的快速效价检测。

2.  CAR-T检测的检测设计和工作流程


检测流程

1. 铺板表达TAA的HiBiT靶细胞;

2. 加入CAR-T细胞;

3. 加入HiBiT检测试剂;

4. 读板。


特点

●  低水平自发释放(<10%最大释放)

●  信号仅来自靶细胞

●  简单、快速和灵敏


优势及应用:

Promega开发了生物发光靶细胞杀伤生物测定平台,用于探索和开发T细胞重定向癌症疗法。

基于HiBiT的CAR-T和TDCC检测

● 使用HiBiT互补技术,可测定混合培养物中的靶细胞特异性杀伤情况;

● 反映CAR-T、TCR-T和BiTE疗法的作用机制(MOA);

● 适用于延时孵育时间和批间比较;

● 可使用多种生理学相关靶细胞进行检测;

● 添加、混合、读取这一简单操作模式均相、灵敏和快速。

01

NanoBiT® TCK检测的抗原特异性

A.)将使用CAR-19或GFP对照慢病毒转导的T细胞与具有不同E:T比值的Ramos/HiBiT靶细胞进行混合。过夜孵育后,加入NanoBiT®细胞外检测试剂,并使用GloMax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。使用洋地黄皂苷透化靶细胞测定最大释放量。

B.) 将CAR-19 T细胞与Ramos/HiBiT靶细胞或Ramos/HiBiT CD19敲除靶细胞进行混合。

02

延长检测孵育时间可显示系列TCK效应

将使用CAR-19或GFP对照慢病毒转导的T细胞与具有不同E:T比值的Ramos/HiBiT靶细胞进行混合。孵育规定时间后,加入NanoBiT®细胞外检测试剂,并使用Glomax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。EC50随时间发生左移,表明在较低E:T比值下可连续实现靶细胞杀伤。


03

NanoBiT® TCK检测法可反映批间效价差异

使用CAR-19慢病毒转导T细胞,然后分别使用IL-7、IL-15或同时使用两种细胞因子,在5ng/mL浓度下对其进行扩增。8天后,对各批次中CAR19+细胞的密度进行标准化处理,并将细胞按照规定比例与Ramos/HiBiT靶细胞合并后处理24小时。然后加入NanoBiT®细胞外检测试剂,并使用GloMax® Discover微孔板读数仪读取发光信号。


04

靶细胞背景和应用

靶细胞

代表性靶抗原

Raji

CD19、CD20

Ramos

CD19、CD20

H929

BCMA

A549

EGFR

SK-BR-3

HER2

SKOV3

HER2、EGFR

OVCAR-3

HER2、EGFR

CHO

外源性靶标表达,包括mTNFa、CD19、病毒抗原

K562

验证过的NanoBiT®靶细胞杀伤应用

ADCC(PBMC)

CAR-T(CD4+/CD8+T细胞)

TDCC(活化CD8+T细胞)

ADCP(巨噬细胞)

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05

多个肿瘤细胞系的TDCC检测


检测流程

1.    铺板HiBiT靶细胞;

2.    加入TDCC预确认CD8 T细胞;

3.    加入CD3xTAA双特异性分子;

4.    孵育;

5.    加入HiBiT检测试剂;

6.    读板。


06

NanoBiT® TDCC可测定悬浮和贴壁靶细胞系中的BiTE效价

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