探索和开发分子和细胞水平的T细胞重定向疗法的新型生物发光生物活性测定法
1. 分子水平的T细胞重定向：CD3双特异性
● CD3双特异性分子可同时结合T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的肿瘤抗原；
● 双重结合可诱导T细胞活化和增殖、细胞因子释放和肿瘤细胞特异性裂解。
2. 细胞水平的T细胞重定向疗法
● 适应性T细胞疗法使用最初从患者或正常供体采集的工程T细胞；
● 用嵌合抗原受体（CAR）或新的T细胞受体对T细胞进行改造，从而识别特异性肿瘤抗原；
● 一旦修饰后的T细胞与癌细胞上的抗原发生结合后，即可诱导T细胞活化和增殖、细胞因子释放和肿瘤细胞特异性裂解。
生物活性测定平台及优势：
Promega开发了生物发光T细胞生物测定平台，用于探索和开发T细胞重定向癌症疗法。
用于筛选和表征抗原特异性治疗性TCR的TCRαβ缺陷型报告基因T细胞
● TCRαβ缺陷型报告基因T细胞可阻止内源性和转基因TCR发生重组；
● CD4+和CD8+变体能够筛选针对MHCI或MHCII依赖性抗原的治疗性TCR。我们还提供了CD4/CD8双阳性细胞，其可促进无MHC偏倚的筛选。
基于HiBiT的T细胞依赖性细胞毒性（TDCC）检测
● CD8 TDCC检测采用HiBiT互补技术，可测定混合培养物中的靶细胞特异性杀伤情况；
● 该检测法均相、灵敏且快速。
用于细胞因子检测的Lumit™ Immunoassays
● 该检测法采用NanoBiT®互补技术，并使用NanoBiT®标记的抗体进行细胞因子检测；
● 该检测法均相、快速且灵敏；
● 检测信号与细胞因子水平之间呈线性相关。
01
TCRαβ-KO报告基因T细胞系用于治疗性TCR的筛选和表征
CD4+ TCRαβ-KO报告基因T细胞系的开发。
● 响应TCR信号的萤光素酶报告基因的稳定整合。
● 采用CRISPR敲除内源性TCRα和β链，从而防止内源性和转基因TCR链的重组。
上图：采用表型检测分析确认TCR α和β链的敲除。
使用对照DNA、TCRα链、TCRβ链或α+β质粒（含GFP转染ctrl）瞬时转染TCRαβ-KO（CD4+）细胞。采用流式细胞术（抗TCR Ab克隆IP26）分析测定TCR表面表达水平。序列分析证实实现了完全敲除（数据未呈现）。
上图：HA1.7 TCR链重新引入TCRαβ-KO（CD4+）细胞导致血凝素肽依赖性活化。
抗原特异性TCRα和β链的表达导致MHCII阳性细胞呈递的流感HA肽剂量依赖性报告基因活化。
02
TCRαβ-KO报告基因细胞可用于抗原肽特异性和效价排序
图
A) 将稳定表达HA1.7 TCR的TCRαβ-KO（CD4+）细胞与HLA-DR阳性细胞和来自不同流感毒株的HA肽进行共同孵育，如图所示。
B) 将稳定表达MART-1特异性DMF5 TCR的TCRαβ-KO（CD8+）细胞与HLA-A2阳性细胞和MART-1肽进行共同孵育，如图所示。图下方表格列出了肽序列。红色字母表示相较于母本序列的变化。
03
表达DMF4的TCRαβ-KO (CD8+) 细胞对MART-1的应答效率高于TCRαβ-KO (CD4+) 细胞
TCRαβ-KO (CD8+) 报告基因细胞通过敲除TCRαβ-KO (CD4+) 报告基因细胞的CD4和外源性CD8工程经随机整合而产生。
采用流式细胞术分析测定TCRαβ-KO (CD4+)和TCRαβ-KO (CD8+) 细胞的CD4和CD8表达水平。
红色：TCRαβ-KO (CD4+) 报告基因细胞
蓝色：TCRαβ-KO (CD8+) 报告基因细胞
● 将瞬时表达DMF4（MART-1特异性）TCR的TCRαβ-KO (CD4+) 和TCRαβ-KO (CD8+) 报告基因细胞与A375细胞（HLA-A2+）和MART-1肽滴定（26-35）进行共同孵育。
● 在两种细胞系中均观察到相似水平的TCR表面表达（数据未呈现）。
表达DMF4 TCR的TCRαβ-KO (CD8+) 报告基因细胞对MART-1/HLA-A2的应答强于CD4+细胞，证明此类型TCR/肽配对对有效抗原刺激具有CD8依赖性。
我们还提供CD4和CD8双阳性TCRαβ-KO细胞，其可用于无偏倚筛选用途（数据未呈现）。
04
靶细胞特异性杀伤的T细胞依赖性细胞毒性（TDCC）检测
● 将CD8 T细胞、CD3xTAA（肿瘤相关抗原）双特异性分子和表达HaloTag®-HiBiT的TAA+靶细胞共孵育可导致T细胞活化和靶细胞裂解，进而将HaloTag®-HiBiT蛋白释放至培养基中；
● HiBiT可与HiBiT检测试剂中的细胞不可渗透LgBiT进行结合，从而形成功能性NanoBiT®萤光素酶并发光；
● 可实现终点或动力学参数的便捷、快速检测；
● 均相、灵敏、无需进行培养基转移。
检测流程
1. 铺板HaloTag®-HiBiT靶细胞；
2. 加入TDCC预确认CD8 T细胞；
3. 加入CD3xTAA双特异性分子；
4. 孵育；
5. 加入HiBiT检测试剂；
6. 读板。
特点
● 低水平自发释放（<10%最大释放）；
● 信号仅来自靶细胞；
● 简单、快速和灵敏。
05
测定CD3xTAA双特异性分子效价的TDCC检测
06
用于细胞因子检测的均质型 Lumit™ Immunoassays
检测流程
1. 铺板TAA+靶细胞；
2. 加入TDCC预确认CD8 T细胞；
3. 加入CD3xTAA双特异性分子；
4. 孵育24小时；
5. 加入目标细胞因子的NanoBiT® 标记抗体；
6. 孵育1小时；
7. 加入检测试剂；
8. 读板。
特点
● 简单、快速和灵敏；
● 均相，无需进行洗涤步骤。
07
Lumit™ Immunoassays测定活化CD8 T细胞产生的IL-2和IFN-γ
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