在体外培养第7 天时，对活的iPSC 衍生神经元细胞使用三种位于绿色、红色和远红色光谱区的HaloTag^®配基进行染色。在第7 天更换细胞培养基的同时，向培养体系中添加了JF503 和JFX554 这两种配基，并孵育30 分钟。为了去除多余的配基，进行了更换一半培养基的处理。JF635 是一种荧光生成型配基，背景极低，在加入到细胞培养物中时无需额外去除培养基，这样可以最大限度地减少对神经元细胞培养环境的干扰。

实验表明，HaloTag^® 配基对iPSC 衍生的神经元细胞并无细胞毒性影响。在细胞培养的第7 天，向神经元细胞中添加200nM 浓度的HaloTag^® 配基。48 小时后，使用CTG 2.0 试剂盒对细胞进行了活力检测。结果显示，经HaloTag^® 配基处理的细胞其相对发光单位（RLU, Relative Light Units）与对照组相比无显著差异。

神经元细胞在培养第0 天时使用JF635 HaloTag^® 配基对其进行标记。这些细胞被放置在一个活细胞腔室中，并通过共聚焦显微镜进行成像。在不添加新的配基的情况下，每隔15 分钟对细胞采集一次图像，持续记录15 小时。在整个长时程且频繁的成像过程中，在捕捉到神经突起生长的同时，未观察到荧光漂白（photobleaching）现象。

将HaloTag^® 标记的神经元细胞培养7 天。到第7 天时，稳定表达GFP（绿色荧光蛋白）的小胶质细胞被接种到已经成熟的神经元培养体系中，从而形成共培养系统。到第11 天时，使用JF635 或JFX554 这两种不同颜色的HaloTag^® 配基对共培养体系进行染色处理。实时获取的图像展示了在与小胶质细胞（BrainXell）共培养条件下，利用单一HaloTag^® 报告基因系统结合两种不同颜色的配基，能够有效区分两种不同类型的细胞，且这种技术也更具灵活性。

BrainXell 公司成功构建了稳定表达HaloTag^® 和NanoLuc^® 报告基因的神经元细胞。

A. 在培养第10 天时，将这些细胞以三种不同的密度接种，并对生物发光信号进行了定量测定，结果显示细胞数量与生物发光信号之间存在线性关系。当NanoLuc^® 与感兴趣的蛋白质（POI）融合时，这一方法同样适用于评估蛋白质丰度。

B. 这些具有生物发光特性的活神经元细胞能够在GloMax^® Galaxy 生物发光成像仪上进行成像。

●iPSC（诱导多能干细胞）来源的稳定表达荧光HaloTag^® 和发光NanoLuc^® 报告基因的神经元细胞能够成功地被制备和培养并利用该报告基因系统进行成像。

● 使用HaloTag^® 荧光配基染色神经元，能够使细胞在共培养条件下被标记上多种不同颜色的荧光，从而实现共聚焦成像，并且在进行时间序列成像时，未显示出明显的光漂白迹象。HaloTag^® 配体在至少48 小时内的使用是无毒的。

● NanoLuc^® 生物发光报告基因则允许活细胞定量细胞的数量以及进行细胞的成像研究。