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基本介绍
细胞内的信号传递在很大程度上是通过蛋白质动力学介导的，包括蛋白质丰度、相互作用、定位及翻译后修饰的变化。尽管通常采用过表达报告基因的方法来研究蛋白质的行为，但CRISPR/Cas9技术提供了一种可能性，即在内源位点对基因进行报告基因标记，从而保持与结合伴侣之间的生理表达水平、调控和计量比。由11个氨基酸组成的肽段HiBiT是一个理想的标签，用于研究内源性表达蛋白质的动力学。
HiBiT的小尺寸便于利用Cas9和gRNA的核糖核蛋白复合物以及合成的单链寡核苷酸donor DNA实现快速敲入标签。HiBiT与18 kDa的LgBiT亚基高亲和力互补生成明亮的萤光素酶NanoBiT®，从而实现在7个数量级线性动态范围内对HiBiT标记蛋白质的灵敏定量。
蛋白质丰度的变化可以通过纯化LgBiT蛋白进行裂解终点检测或在细胞中表达LgBiT亚基进行活细胞动力学检测的方式来监控。HiBiT标记蛋白质与HaloTag融合蛋白的相互作用可以利用生物发光共振能量转移（BRET）在活细胞中进行测定。
HiBiT标签以及内源性标记方法
● HiBiT 与 LgBiT 之间的高亲和力相互作用（解离常数 KD = 700 pM）促使二者能够自发形成一种酶，在底物 furimazine 存在的条件下这种酶能产生明亮的发光信号且具有发光动力学特点。
● HiBiT 可以与蛋白质的 N 端或 C 端融合，也可以插入到蛋白质内部易于接近的位置。
快速、无需克隆的CRISPR Knock-In 工作流程：
1. 设计和订购：
• Guide RNA (crRNA + tracrRNA)
• HiBiT Donor DNA (ssDNA oligo)
• 纯化的 Cas9蛋白
2. 组装核糖核蛋白复合体（RNP Complex）
3. 将RNP Complex和Donor DNA导入细胞（电转）
4. 孵育24-48小时
5. 加入HiBiT检测试剂检测发光信号
多种检测模式
01
直接检测HiBiT标记的蛋白
● HiBiT裂解检测：在细胞裂解物、IP复合物或其他样本中灵敏的检测HiBiT标记的蛋白；
● HiBiT胞外检测：检测活细胞表面或分泌型表达的HiBiT标记的蛋白；
● HiBiT印迹检测：简单、灵敏地检测印迹膜上HiBiT标记的蛋白；
● 活细胞的胞内HiBiT检测：在细胞内表达LgBiT, 动态检测细胞内的HiBiT标签蛋白。
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02
在BRET检测中将互补HiBiT作为供体
可以作为BRET受体的是：
● 用于蛋白质相互作用检测的 HaloTag 融合蛋白
● 用于小分子互作研究的荧光示踪化合物
● 用于翻译后修饰检测的带标记二抗
应用数据展示
01
使用裂解型检测系统在广泛的动态范围内定量蛋白丰度
PROTACs靶标蛋白降解
利用HiBiT裂解检测系统监测内源表达的 HiBiT 标记蛋白的降解调控。
● 裂解型检测试剂 ：LgBiT 蛋白、底物furimazine和洗涤剂（均质型；<10 分钟；辉光动力学）。
● 灵敏度可达 0.1 attomoles（相当于3 fg 的 30kDa 蛋白），是监测内源水平表达的理想选择。
02
在活细胞中定量蛋白丰度
● 在细胞中表达LgBiT，进行活细胞、实时监测内源性表达的HiBiT标签蛋白；
● 实时监测蛋白降解的可逆变化
03
基于NanoBRET技术检测蛋白：蛋白相互作用
● 内源性表达的 HiBiT 标签蛋白与稳定表达的 LgBiT结合（BRET 供体）。
● 外源表达的 HaloTag 融合蛋白与荧光染料结合（BRET 受体）。
● 用 MZ1 处理内源性表达的 HiBiT-BRD4 会增加与 VHL 和ubiquitin的相互作用。
04
检测受体内化
● 快速测定内源性表达的HiBiT标签蛋白在细胞外环境中的含量（5分钟内检测）。
● 细胞外检测试剂：非裂解型缓冲液中的LgBiT蛋白和furimazine底物。
● 监测蛋白内吞作用、向细胞膜表面的转运过程或分泌活动。
05
检测翻译后修饰（PTM）
● 利用 BRET 监测内源表达的 HiBiT 标签蛋白的 PTMs
● 内源表达 EGFR-HiBiT 的磷酸化
● 激动剂和抑制剂处理后 BRET 比率出现预期变化
06
结论
Promega应用这些检测方法研究了PROTAC化合物诱导的含溴结构域蛋白BRD4的降解，并显示了细胞裂解液和活细胞中内源性表达的HiBiT-BRD4的减少，以及与E3连接酶复合物和泛素相互作用的增加。HiBiT还可以用于在活细胞分析中测量蛋白质的膜渗透性，利用LgBiT的膜不可渗透性来测量蛋白质向细胞表面和从细胞表面的转位，并展示了在几分钟内即可通过检测胞外HiBiT信号损失的方式，测定内源性表达的HiBiT-EGFR和HiBiT-β2-AR的内化过程。此外，通过测量HiBiT/LgBiT复合体到荧光标记的二抗的BRET，可以在均相检测中监测激活后HiBiT-EGFR的磷酸化情况，以监控抗磷酸抗体的结合。
技术资源
HiBiT蛋白标签技术-讲座
HiBiT蛋白标签系统-介绍
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