活细胞中PROTAC和分子胶
靶向降解的实时监测方法
靶向蛋白降解作为一种广泛、新型治疗方法的出现，极大丰富了治疗多种疾病的机会。目前，小分子降解化合物可分为两大类：分子胶和异双功能PROTAC。这两类化合物既可促进同时还可诱导由E3连接酶-降解剂-靶蛋白组成的三元复合物，使泛素化所需的作用蛋白互相靠近，从而最终降解靶蛋白。考虑到不同化合物之间蛋白质降解和恢复的动力学的差异，在活细胞中针对降解化合物的表征和排序方面仍存在重大挑战。目前，实时检测蛋白质降解的技术仍非常缺乏。
Promega提供了一个基于发光信号进行相关测定的技术平台，其可对活细胞中的降解化合物进行表征并对其进行排序。我们使用含小肽（HiBiT标签）的CRISPR/Cas9内源性标记靶蛋白进行了相关检测，HiBiT对LgBiT蛋白具有高亲和力，且其还可与LgBiT蛋白进行互补从而产生NanoBiT®发光信号(更多HiBiT技术应用知识请点击此处)。
这一技术可实现对活细胞中内源性蛋白水平的高灵敏性检测，其也可作为BRET能量供体从而对蛋白质间相互作用或蛋白质与小分子间相互作用进行相关研究。我们不仅证明了该技术在连续24小时监测内源性靶蛋白水平方面的良好能力，同时还证明了其在定量测定化合物排序所涉及关键降解参数（包括速率、Dmax和Dmax50）方面的能力。此外，我们还进一步证明了该技术在确定降解重要机制步骤方面的能力，具体包括PROTAC或分子胶诱导的三元复合物形成和靶向泛素化的动力学。这些研究有助于识别实现成功降解所需的单个参数，从而最终在制定化学设计策略时能够针对治疗性降解化合物进行最大程度优化以及排序。
靶向蛋白降解剂：PROTAC和分子胶
HiBiT CRISPR标记的策略与实验方法
PROTAC诱导的活细胞降解动力学
BRD4的HiBiT内源性标记和动力学降解
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使用CRISRP/CAS9技术给BET家族蛋白内源性标记上11AA的HiBiT融合标签
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利用 GloMax® Discover仪器测得的连续发光读数进而确定细胞降解的完整特征
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测定了降解速率、Dmax和Dmax50，从而对化合物和BET家族蛋白进行排序
分子胶诱导的活细胞降解动力学
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观察分子胶靶标的降解情况，并可通过降解速率、Dmax和Dmax50对化合物进行排序
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Iberdomide显示出最强效降解作用
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可用于反筛PROTAC（带有胶水结合部分）
对细胞活力和Iberdomide诱导的Ikaros降解进行多重检测
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确认信号损失（降解）并非由于对活性的影响所致
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动力学可用于辅助区分随后可能导致毒性的靶标降解
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使用不同的活性检测方法测定不同毒性阶段
动力学多重检测：
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CellToxTM-Green：膜完整性
终点法多重检测：
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CellTiter-FluorTM：活性细胞蛋白酶
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CellTiter-Glo® (CTG)：细胞ATP水平
使用PROTAC和分子胶的活细胞NanoBRET三元复合物动力学
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在单次NanoBRETTM检测中同时监测三元复合物的形成和伴随的靶标降解情况 -
使用内源性HiBiT融合的靶蛋白，或异位表达
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使用MG132可增加信号窗口
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动力学分析可实现对细胞三元复合物稳定性的相关研究
使用PROTAC和分子胶的活细胞NanoBRET泛素化动力学
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监测PROTAC或分子胶诱导的靶向泛素化动力学。
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使用内源性HiBiT融合的靶蛋白，或异位表达
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使用具有不同效价和E3募集的化合物观察到的差异靶向泛素化
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泛素化水平与降解速率具有相关性
NanoBRET方法检测PROTAC和分子胶对E3连接酶结合亲和力及细胞膜通透性
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在活细胞或透性化细胞（A和B）中进行NanoBRET靶标结合测定，从而实现对化合物亲和力和渗透性的评估。
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MZ1在与VHL发生结合时具有与单价VH298相同水平的亲和力（裂解物），但其渗透性（活细胞）低于单价VH298。
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分子胶图中显示了与CRBN的结合亲和力范围，并且均具有良好的细胞渗透性（活细胞与透性化细胞）。
结 论
差异化细胞技术可用于研究PROTAC和分子胶介导降解的关键作用过程，从而实现对化合物的更高效分析
HiBiT和NanoLuc®技术：
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活细胞动力学降解
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可与CRISPR联合使用从而对内源性蛋白进行研究
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可实现对关键降解参数的定量测定
NanoBRETTM技术：
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监测活细胞中的动态通路相互作用和信号转导机制
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可用于评估PROTAC细胞渗透性
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实时监测诱导的与E3连接酶组分间的相互作用和靶向泛素化
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实现对降解动力学作用机制的相关了解
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