关键词：G蛋白偶联受体（GPCR），生物发光检测，活细胞动态监测，GPCR内化，GPCR互作，第二信使cAMP检测。
快速了解本篇文章介绍重点。
要点概述
Promega用于监测GPCR药理学的技术与测定方法：
● NanoBiT®平台
• 小标签最大限度地减少了对融合伴侣生物活性的干扰
• 明亮的生物发光提供了极高的灵敏度，例如在内源性表达水平上进行检测
● 监测配体诱导的内化作用
• GPCR内化和循环利用的定量
• 动力学与终点法分析
● 监测GPCR与β-arrestin-2的相互作用
• 简单的操作流程，强大的信号背景比(S:B)
● cAMP的实时与终点法检测
● 基于细胞的均质型测定方法
• 适用于自动化和高通量筛选
基本介绍
G蛋白偶联受体（GPCRs）一直是新型治疗药物的关键靶标。为了支持这些研究工作，我们开发了一套生物发光检测方法，能够在活细胞中实时研究GPCR的动力学。受体内化和循环过程的量化是基于对受体N端进行HiBiT (一个11个氨基酸的肽段)的融合。HiBiT能以高亲和力与LgBiT结合，形成NanoBiT®萤光素酶。之后加入一种非裂解性检测试剂，其中包含不可透膜的LgBiT和furimazine底物。通过对HiBiT标记的GPCRs在细胞表面密度变化的实时监测，来跟踪受体的内化和循环过程。值得注意的是，NanoBiT®萤光素酶发出的强烈信号使得我们能够利用CRISPR/Cas9技术引入HiBiT标签，在内源性表达水平上进行实验。类似地，将LgBiT和SmBiT（另一个对LgBiT有低亲和力结合的11个氨基酸肽段）分别形成融合蛋白可用于实时检测激活的GPCRs对β-arrestin-1/2的招募。此外，通过使用热稳定型或环化突变形式的萤光素酶，可在终点法（cAMP-Glo）或实时检测模式（GloSensor cAMP）下，灵敏地测定细胞内cAMP浓度的变化。这些均质的、基于细胞的检测方法易于适应实验室自动化操作，对于GPCR药理学研究具有极大的价值。
NanoLuc®二亚单元技术（NanoBiT®）
● NanoLuc®在91个不同的位点被分割成两个亚基。
● 位于156/157之间的位点因其自身聚集作用微弱而被选中。
● 大亚基（LgBiT）显著提高了稳定性、表达水平和亮度。
● 已鉴定出具有广泛亲和力范围（超过5个数量级）的小肽段文库。
• SmBiT ——亲和力最低，用于蛋白质:蛋白质相互作用检测。
• HiBiT ——亲和力最高，作为检测用标签。
Dixon, A., et al., ACS Chem. Bio. 2015
应用数据展示
01
使用HiBiT监测GPCR的内化和循环
HiBiT标记技术
● 小标签：仅具有11个氨基酸；
● 高灵敏度：
• 与LgBiT高亲和力互补时产生明亮的生物发光
• 允许在内源性表达水平上进行分析
● 可选择性进行细胞表面检测：得益于LgBiT的细胞非透膜性；
● 简化的CRISPR/Cas9敲入流程：减少人工干扰。
监测内吞与回收过程
● 定量：测定HiBiT-GPCR细胞表面密度的变化
● 简单：添加-读数检测法，在4分钟内即可定量表面表达
● 动力学：非裂解型检测，实时动态检测
02
配体诱导的β2-肾上腺素受体（β2-AR）内化与循环
● 使用不同配基研究β2-AR内化作用，与已报告的值总体一致；
● 实时监测受体的内化与循环过程。
03
使用NanoBiT®双向载体系统（BiBiT）测定β- Arrestin-GPCR相互作用
● 使用单独的抗性基因或BiBiT方法构建稳定的细胞系；
● SmBiT与LgBiT的互补依赖于β-Arrestin-GPCR的相互作用。
04
实时监测β-Arrestin2相互作用
● 实时监测GPCR与β-arrestin-1/2的相互作用；
● 低表达水平下检测相互作用。
05
实时检测CX3CR1:β-arrestin-2相互作用
● 该方法在1536孔固体白色微孔板中运行。
● Z'因子从36次重复测量中计算得出 。
● 具有低变异性、稳健的测定方法
06
cAMP的实时与终点检测方法
● 实时监测细胞内[cAMP]的变化
● 具有宽广动态范围的高灵敏度检测方法
● 对裂解物中[cAMP]变化进行灵敏地终点法检测
技术资源
GPCR信号通路研究工具
HiBiT蛋白标签系统
蛋白相互作用研究解决方案
NanoBiT®蛋白互作研究
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