荧光配基在生物研究中的应用：
回顾过去，展望未来
荧光标签（荧光基团）已成为标记细胞和及其组分的出色工具。它们可用于大分子（如蛋白质）、细胞组分和酶（如转录因子）的成像。一旦使用了正确的标签，便可在组织或细胞中动态追踪这些分子。
那么何谓“正确的”标签呢？它应具备明亮的信号，低背景噪声以及良好的光稳定性。对于像细胞器这样的小型细胞组分而言，标签必须能够穿透细胞膜，并且足够小，以避免干扰正常的细胞过程，如转录和代谢。
01
透过文献看荧光标签的发展
在过去二十年里，荧光标签领域取得了重大进展。下面我们将探讨几篇论文，它们记录了这些进步。
文献1
Wysocki and Lavis (2011). Advances in the chemistry of small molecule fluorescent probes. Current Opinion in Chemical Biology, 15, 752–9.
这篇综述回顾了2011年小分子荧光基团的状况，强调了这些工具在推进细胞事件研究中的重要性。作者们通过化学修饰激活荧光基团，得到了更亮的合成染料，这有助于调控荧光的定位和时间。
例如，当时在药物化学中广泛使用的钯催化的反应，开始应用于染料合成，以构建一系列罗丹明化合物库。在另一例中，钯被用来将羟基香豆素化合物转化为类似结构的氨基香豆素，得到一种在宽pH范围内具有良好荧光的染料，非常适合在细胞微环境中使用。
荧光染料的核心结构元素经过化学修饰进行调整，用于研究结构-活性之间关系。将这些染料在活细胞中进行筛选，有助于确定它们的细胞特异性。并且，应用组合化学技术开发出可调节发射波长的染料。
作者们讨论了可以用酶易裂基团遮蔽的荧光底物，这使得荧光探针能够被定位，并且其荧光可通过内源或外源性蛋白调节，从而形成开关效应。改善释放的荧光团的稳定性和局部分布控制了背景荧光，提高了空间上识别酶活性的能力。
荧光酶底物的化学稳定性对于生物成像至关重要。例如，Wysocki等人将荧光素上的乙酸酯替换为乙酰氧甲酯，用稳定脂肪族酯替换了不稳定的酚酯，利用一个在酯键断裂后分解的间隔基团。
使用这些工具的终极目标是成功地在活细胞中对靶蛋白进行成像。21世纪初见证了自标记蛋白标签的发展，如SNAPTag和HaloTag®。通过对这些蛋白标签进行化学修饰，增加其荧光激活能力和改善细胞膜渗透性，优化了它们在标记中的应用。
总之，Wysocki和Lavis预测了进一步的化学方法，用于控制荧光基团的定位和激活，从而改进它们在生物研究中的应用。
文献2
Presman, D.M. et al.（2017）Quantifying Transcription Factor Binding Dynamics at the Single-molecule Level in Live Cells. Methods 123, 76–88.
在这篇论文中，研究者们利用糖皮质激素受体作为模型，通过单分子追踪（SMT）技术研究转录因子。
在讨论荧光基团的选择时，作者指出尽管遗传编码的荧光蛋白如绿色荧光蛋白（GFP）的发现彻底改变了活细胞成像，但这些蛋白质的亮度和光稳定性较差，因此并不理想，尤其是对于可能持续时间较长的染色质结合事件。此外，像Alexa Fluor、Cy和ATTO这样与蛋白质偶联的荧光团很难引入细胞中，需要对单个蛋白质进行显微注射。
相反，作者选择使用自标记标签类型的化学荧光团，如HaloTag®。
HaloTag®是一种细菌脱卤酶的变异体，能快速且特异性地与氯代烷配体反应。HaloTag®经过工程改造，使得催化过程停留在酯中间体阶段，这使得HaloTag®能够用于共价标记研究中的蛋白质。SNAP-tag和CLIP-tag基于相同的原理，与HaloTag®互补，可以进行多色成像。
作者考虑了荧光标签和标记系统是否会影响结果数据、引入偏倚。为了解答这个问题，他们比较了使用Janelia Fluor®（JF549）配基标记与HaloTag®、SNAP-tag和Click-tag系统的差异，以糖皮质激素受体作为转录因子模型。
关于JF549与不同系统结合后的光稳定性，他们发现HaloTag®-JF549共轭物的光稳定性优于JF549-SNAP-tag或JF549-Click-tag系统。
他们通过单细胞研究表明，转录因子与染色质的相互作用出乎意料地动态。
文献3
Meissner, G.W. et al.（2018）Optimization of fluorophores for chemical tagging and immunohistochemistry of Drosophila neurons.
PLOS ONE 13, e0200759.
Meissner等人探索了用于黑腹果蝇神经元化学标记和免疫组织化学的荧光基团优化。
该研究建立在现有的自标记标签技术基础上，这些技术使用小分子配基与基于酶的遗传编码标签共价结合。这种方法因其更快的处理速度和更低的背景染色而著称，与传统的免疫组织化学（IHC）相比，它克服了诸如组织穿透性差和染色背景高的常见问题。
该研究引入了四种基于Cy、Janelia Fluor®、Alexa Fluor®和ATTO染料的新荧光配基。这些配基旨在与最近改进的果蝇转基因兼容，并显示出增强的标记强度，展示了相较于第一代化学标签报告子的显著进步。
作者展示，使用DPX（一种基于二甲苯的封片介质）进行组织透明化，当使用非花青染料时，能显著提高信号质量，从而使得神经元结构的成像更加清晰、更易于区分。
Meissner等成功地将化学标记与标准免疫组织化学技术相结合。这种方法结合了化学标签的特异性和快速标记特性，以及基于抗体检测的稳健性，为详细的神经元研究提供了一个全面的工具箱。
此外，他们进行了一系列方法学上的改进和比较：
• 合成了新的荧光团，并评估了其在固定组织标记的有效性，特别是关注它们的亮度和稳定性。
• 新开发的标签直接与传统IHC方法进行了对比，注意到在速度和信噪比方面的改进。
• 新方法的实用性在实际实验设置中得到了验证，包括在果蝇大脑中详细神经元映射，突出了其在神经科学研究中的实用益处和广泛应用的潜力。
总结来说，这些研究标志着在神经元成像和标记领域向前迈出的重要一步。通过优化用于化学标记的荧光团，并将其与传统的IHC方法结合，他们开发了一种更高效、更稳健的研究神经元结构的方法。这项工作不仅增强了在像果蝇这样的模式生物中可视化神经回路的能力，也为基于荧光的成像技术的进一步创新奠定了基础。
文献4
Hensel et al.（2024）Rapid in-EPON CLEM: Combining fast and efficient labeling of self-labeling enzyme tags with EM-resistant Janelia Fluor dyes and StayGold. Heliyon 10, e28055.
2024年3月，Hensel等人发表了一项研究，介绍了一种简化且高效的方法，通过将自标记酶标签与EM抗性的Janelia Fluor®染料和StayGold荧光蛋白结合，实现了树脂内相关光电子显微镜（CLEM）的流程。这种组合旨在解决在电子显微镜（EM）样本制备的严苛条件下保持荧光的挑战。
Janelia Fluor®染料特别设计用于增加亮度和光稳定性，使之成为CLEM工作流程的理想候选者。该研究评估了多种Janelia Fluor®染料，包括JF479、JF525、JF549、JFX549、JFX554、JF585、JF646、JFX646和JFX650，考察它们在传统包埋（CE）过程（包括锇酸固定、脱水和EPON包埋）后保留荧光的能力。
他们发现：
• JFX549和JFX554染料具有最佳的荧光保留能力，在EPON切片中相比传统的四甲基罗丹明（TMR）染料多保留了近20%的荧光。这些染料提供了稳定且可重复的荧光信号，便于光学显微镜（LM）图像与电子显微镜（EM）图像之间的精确相关性。
• JF549同样保留了荧光，但对EM样本制备的细微变化更为敏感。
• JF479、JF585及远红染料（JF646、JFX646、JFX650）未能有效保留荧光。
总结：
• 本研究成功展示了使用HaloTag®和SNAP-tag或HaloTag®和StayGold的组合实现了双荧光CLEM，这使得不同的细胞结构能够同时可视化。
• 以光稳定性著称的绿色荧光蛋白StayGold在树脂中保留了荧光，使得双荧光CLEM工作流程无需进行特殊的调整。
• 该研究突出了CLEM工作流程中快速、高效标记和成像的潜力，使其可在各种实验室常规使用。
• 这种方法特别有利于研究细胞内标记蛋白的超微结构背景，促进细胞和分子生物学研究的进步。
本研究确认JFX549和JFX554是最有希望用于树脂内CLEM的Janelia Fluor®染料，因为它们具有优异的荧光保留能力和稳定性。这些染料与自标记酶标签和StayGold蛋白的结合为高精度相关显微镜成像提供了一种强大且通用的方法，增强了详细可视化细胞结构的能力。
02
总结
从2011年至2024年的这些论文，展示了HaloTag®和Janelia Fluor®配基的发展和应用。这些论文涵盖了从提出荧光染料化学修饰的时期，到通过化学修饰提高染料性能的时期，允许其在细胞深层探索中应用，再到因染料改进而扩展至新研究领域的历程。
HaloTag® Janelia Fluor®染料是我们最亮、最具功能性的荧光染料。在共聚焦成像中提供增强的亮度，这些染料专为超分辨率技术设计。我们提供的HaloTag® Janelia Fluor®配基涵盖了可见光谱的全部范围。
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相关资源
1. 产品详情
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2. 技术介绍手册
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