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来源：发布时间：2024/7/19 14:47:00

选择荧光染料或配基时的考虑因素

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荧光染料在其历史长河中，使得有机组织和细胞培养的可视化成为可能，为众多求知若渴的科学家打开了生物学内部结构的大门。观测这些标本内部为我们揭示了对生物研究、医学治疗乃至药物开发至关重要的生化过程（Grimm & Lavis, 2022）。随着过去一个世纪以来开发出的广泛荧光工具，设计实验时选择最佳染料或荧光配基可能会让人感到无所适从。你可能会发现自己不自觉地倾向于最流行或最熟悉的选项。然而，这一选择至关重要，因为它将影响实验的下游结果，包括发现的准确性和有效性。如果你在选择合适的荧光工具方面遇到困难，这篇文章将为你提供帮助。我们将概述在选择染料或配基时需要考虑的一些基本原则，以简化你的选择过程，并突出该领域的一些最新进展。

荧光染料/配基的基本原理

上图：荧光基团、荧光染料和荧光配基的示例结构。

此图由biorender.com绘制

荧光是指一种物质（荧光基团）吸收光或电磁辐射后在另一波长处发射光的现象（Heinrichs, 2009）。当荧光基团吸收光时，电子通过吸收光子从基态跃迁到激发态。在短暂的激发态提升之后，电子通过发射一个能量略低的光子返回基态，这是由于非辐射能量损失。这种发射上的差异导致发射的波长略长于吸收的波长。这一现象被称为斯托克斯位移，即峰值激发光谱和发射光谱之间的波长差。荧光染料通过将这些荧光团与对内源性分子靶标具有高亲和力的分子种类结合来利用这些荧光团，这意味着染料将通过分子种类的结合附着在靶标上。这些染料的施用导致染料与内源性靶标的直接结合，因此无需遗传编码的标签。这些染料也可以连接到抗体上来检测各种目标，比如蛋白质、核酸或糖链。

荧光团还可以共价连接到自标记蛋白上。一些常见的自标记蛋白例子包括SNAP-tag^{^®}和HaloTag^{^®}。这些蛋白由基因编码的酶变体标签组成，该标签能与连接有荧光团的小底物配基基序共价反应。当与感兴趣的蛋白配对时，这些工具通过荧光标记提供了更容易识别目标的手段。与传统的荧光蛋白标签相比，使用这些自标记蛋白有几个优点，包括更高的特异性、探针连接的更大灵活性，以及与远红光和近红外荧光团的兼容性。

荧光显微镜利用这些荧光团的特性，实现了对细胞组分的高度特异性可视化，通常是感兴趣的蛋白质。荧光染料和配基在化学结构上各不相同，导致它们的激发和发射波长有所区别，这对它们在生物技术中的应用至关重要（Grimm & Lavis, 2022）。这些差异直接影响了如何利用这些染料。最常用的荧光染料是异硫氰酸荧光素（FITC），其激发/发射峰位于495/517nm。FITC与蛋白质上的氨基结合，从而使蛋白质底物/肽段和抗体的标记成为可能。此染料的一个应用实例是将其与抗体偶联，通过蓝色光激发产生的绿色光发射来指示FITC结合的位置。

选择荧光染料/配基的关键考虑因素

Part.1

对蛋白质功能和细胞组分的影响

评估染料结合对蛋白质功能及其与细胞组分结合倾向的影响至关重要。某些染料针对特定的细胞器，如线粒体，而且不同染料与同一蛋白质使用时可导致细胞质背景信号的变化（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。其他染料在活体模型系统中染色细胞内隔室可能较为困难，因此需格外注意确保达到恰当的染色效果。荧光配基由于通常与亲和标签结合，因此具有更大的灵活性。

Part.2

荧光稳定性

对于涉及宽pH范围和长时间的应用，荧光随时间的稳定性极为关键。例如，异硫氰酸荧光素（FITC）的荧光能稳定地与纳米粒子结合，在60分钟照射后保持约原荧光强度的85%，突显了其对长期实验的可靠性（Salariet et al., 2019）。光稳定性，即在光照下保持荧光强度的能力，是另一个考虑因素。如果实验需要长时间曝光，则需要更加光稳定的荧光蛋白（Mahmoudian et al., n.d.）。在峰值波长激发荧光团也可减缓光漂白速率。

Part.3

与受体的相互作用

了解荧光染料如何与特定受体相互作用尤为重要，特别是在G蛋白偶联受体（GPCRs）方面。受体位点的突变会影响被标记的激动剂和拮抗剂的荧光发射，影响实验结果的解读。需考虑染料如何影响受体构象和信号传导活性（Sridharan et al.，2014）。同样重要的是评估荧光团的添加如何影响配基的功能活性。例如，研究表明不同的荧光配基能引起β-arrestin-2向受体招募的不同程度，表明其激动性质。这些配基的效力和效率会因其荧光团的引入而受到影响，正如在多巴胺D2/D3受体研究中所见（Allikalt et al.，2020）。

Part.4

标记过程的影响

染料标记过程（如与蛋白质的偶联）需仔细管理。适当的染料-蛋白质比例（或标记度，DOL）及彻底去除未偶联的染料分子对于准确可靠的成像和测定结果至关重要（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。低DOL的缀合物往往荧光强度较弱，确定最优DOL的最佳实践是通过多个小批量实验标记。大小也是一个因素。更大的标签，如GFP，可能会干扰活细胞中蛋白质的表达或功能。

Part.5

荧光团特性

荧光团的具体特性，如激发波长和发射光谱，需与实验设置和目的相匹配。大多数系统只能激发和读取有限数量的激发和发射波长，这受限于设备的滤光片立方体和过滤设置。对商业可用的、具有不同激发波长（如绿色、红色和远红外）的荧光团进行系统评估对于细胞内荧光活体成像至关重要（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。染料的亮度也因其各自荧光色素的不同而变化，亮度受激发系数（表征物种在特定波长吸收或反射光或辐射的强度）和荧光量子产率（吸收的光子与发射的光子之比）的双重影响。例如，DAPI比Alexa Fluor 488暗淡得多，因此从背景中观察其染色更加困难。能够穿透细胞膜的染料对于活细胞成像尤为有用。

Part.6

实验背景和配基结合

实验背景，如细胞的存在或特定蛋白质的存在，会影响荧光染料的选择。例如，在某些条件下，额外的细胞蛋白不影响FITC偶联蛋白配体的裂解，这对于实验设计是一个重要因素（Breen et al.，2016）。选择染料时，在实验条件下进行测试很重要。常见问题包括光漂白、非特异性结合和淬灭，这些问题可通过谨慎选择和优化来减轻。

Part.7

荧光实验类型

不同的荧光实验类型，如使用荧光标记的配基或分子间FRET研究配基-受体相互作用，要求针对荧光染料的选择有特定考虑（Sridharan et al.，2014年）。制造商通常会在产品说明或技术手册中推荐特定的荧光供体和受体。

篇幅较长，更多信息请关注下期内容：特定应用与匹配的染料/配基选择

参考文献

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1. Allikalt, A., Purkayastha, N., Flad, K., Schmidt, M. F., Tabor, A., Gmeiner, P., Hübner, H., & Weikert, D. (2020). Fluorescent ligands for dopamine D2/D3 receptors. Scientific Reports, 10(1).

https://doi.org/10.1038/s41598-020-78827-9

2. Breen, C. J., Raverdeau, M., & Voorheis, H. P. (2016). Development of a quantitative fluorescence-based ligand-binding assay. Scientific Reports, 6.

https://doi.org/10.1038/srep25769

3. Grimm, J. B., & Lavis, L. D. (2022). Caveat fluorophore: an insiders’ guide to small-molecule fluorescent labels. In Nature Methods (Vol. 19, Issue 2, pp. 149–158). Nature Research.

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01338-6

4. Grimm, J. B., Muthusamy, A. K., Liang, Y., Brown, T. A., Lemon, W. C., Patel, R., Lu, R., Macklin, J. J., Keller, P. J., Ji, N., & Lavis, L. D. (2017). A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature Methods, 14(10), 987–994.

https://doi.org/10.1038/nmeth.4403

5. Hayashi-Takanaka, Y., Stasevich, T. J., Kurumizaka, H., Nozaki, N., & Kimura, H. (2014). Evaluation of chemical fluorescent dyes as a protein conjugation partner for live cell imaging. PLoS ONE, 9(9).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106271

6. Heinrichs, A. (2009). Stains and fluorescent dyes. Nature Cell Biology, 11(S1), S7–S7.

https://doi.org/10.1038/ncb1939
7. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., & Hajnóczky, G. (2017). Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports, 3(4–6), 64–72.

https://doi.org/10.1007/s41048-017-0037-8

8. Lucidi, M., Capecchi, G., Visaggio, D., Gasperi, T., Parisi, M., Cincotti, G., Rampioni, G., Visca, P., & Kolmakov, K. (2023). Expanding the microbiologist toolbox via new far-red-emitting dyes suitable for bacterial imaging. Microbiology Spectrum.

https://doi.org/10.1128/spectrum.03690-23

9. Mahmoudian, J., Hadavi, R., Jeddi-Tehrani, M., Mahmoudi, A. R., Bayat, A. A., Shaban, E., Vafakhah, M., Darzi, M., Tarahomi, M., & Ghods, R. (n.d.). Comparison of the Photobleaching and Photostability Traits of Alexa Fluor 568-and Fluorescein Isothiocyanate-conjugated Antibody.

10. Salari, M., Bitounis, D., Bhattacharya, K., Pyrgiotakis, G., Zhang, Z., Purington, E., Gramlich, W., Grondin, Y., Rogers, R., Bousfield, D., & Demokritou, P. (2019). Development & characterization of fluorescently tagged nanocellulose for nanotoxicological studies. Environmental Science: Nano, 6(5), 1516–1526.

https://doi.org/10.1039/c8en01381k

11. Sridharan, R., Zuber, J., Connelly, S. M., Mathew, E., & Dumont, M. E. (2014). Fluorescent approaches for understanding interactions of ligands with G protein coupled receptors. In Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes (Vol. 1838, Issue 1 PARTA, pp. 15–33).

https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2013.09.005

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