OPTOPT

来源：发布时间：2024/8/5 8:24:00

特定应用与匹配的染料/配基选择

文末竞答有奖

接：荧光染料/配基的选择策略详解

为了高效地进行活细胞成像，使用低毒性和高光稳定性的染料至关重要。这些特性确保了在较长时间内信号的一致性和稳定性，对于研究诸如线粒体动力学等动态过程特别有利。线粒体稳态通过分裂、融合、生物发生和线粒体自噬等机制维持的过程，可以通过Rhodamine 123（R123）这样的染料进行追踪（Liu et al.，2017）。在多色成像中，选择具有不同发射光谱的染料以避免串扰，减少信号“混淆”，并在分析过程中清晰地区分多种染料是必要的。

图像分辨率

图像分辨率受多个因素影响。首先，更亮的染料通过提高信噪比能检测到更细微的细节。某些染料专门设计用于超分辨显微技术，如受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）和随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。这些染料具有特定的性质，能够实现超越光衍射极限的分辨率。硅罗丹明或Janelia Fluor（JF）染料具有特定性质，使它们适用于超分辨率应用，如卓越的亮度、光稳定性和最重要的是光开关能力。这种光开关指的是在特定刺激下在荧光和非荧光状态之间“切换”的能力，仅留下少量处于激发态的荧光团，有效减少了荧光区域。

染料的特性

在蛋白质标记和分析中，染料应足够小，以免妨碍蛋白质功能，并应具有高特异性以确保准确标记。在荧光共振能量转移（FRET）应用中，染料需要具有兼容的激发和发射特性，以实现有效的能量转移，这对于观察蛋白质间的相互作用和构象变化至关重要。分子间的短距离（<10纳米）和激发光谱的重叠对于准确解释基于FRET的实验至关重要。一种流行的组合是Alexa594和Alexa647，因为它们亮度高且光谱重叠程度大。

用于DNA/RNA染色的染料应具有对核酸的高亲和力和特异性，且背景染色最小。此外，细胞渗透性是一个关键因素，因为它影响染料进入细胞的能力而不引起过度的毒性。DAPI是一个显著的例子，它特异性结合双链DNA的AT富集区，在激发后发出蓝色荧光。虽然它在技术上是细胞可渗透的，但在活细胞中的使用有时由于渗透过程会导致细胞毒性。

荧光染料/配基的先进技术

上图：HaloTag^{^®} Janelia Fluor 配基的激发和发射光谱及对照表

在细胞生物学的历史进程中，荧光标记技术极大地增强了我们对细胞机制的理解。染料化学的进步催生了更加稳定、更亮且更具特异性的染料，扩展了基于荧光技术在生物技术领域的应用能力。最近的发展实例包括Lavis实验室开发的Janelia Fluor^{^®}（JF）染料（Grimm et al.，2017）。这些染料已被改造为配基，用于HaloTag^{^®}技术，目前由Promega提供。得益于HaloTag^{^®}系统提供的可交换标记的灵活性，新的Janelia Fluor^{^®} HaloTag^{^®}配基进一步扩展了该平台的自我标记能力。Janelia Fluor^{^®}配基为超分辨率应用提供了更明亮且更稳定的荧光。其他当前进展还包括在细菌成像中探索远红发光染料的研究，以解决自体荧光带来的限制问题（Lucidi et al.，2023）。

在荧光技术迫切需要进步的特定应用领域中，内源性蛋白的检测尤为突出。传统染料或配基（如mCherry）的荧光强度在尝试检测极低水平的内源性蛋白时可能会遇到挑战。下面展示了一个实验，其中mScarlet和HaloTag（+JF549）被敲入HIF1α（缺氧诱导因子1α亚基）位点，以比较在低水平内源蛋白上的荧光表达（下图）。这些克隆经1μM蛋白酶体抑制剂MG132处理6小时后进行成像。两种克隆的对比清楚地显示，相比于mScarlet克隆，HIFα-HaloTag（+JF549）克隆展现出更明亮的荧光。在另一项实验中，施用了低浓度的邻菲啰啉（2μM）进行刺激，并在6小时后拍摄荧光图像。即使在低浓度的邻菲啰啉作用下，JF549克隆相较于mScarlet克隆仍然显示出更高水平的荧光。Janelia Fluor^{^®}染料最显著的优势之一是它们具有远超于传统染料的荧光亮度。

上图：JF549比mScarlet更敏感，因此能够检测在正常条件或低浓度邻菲罗啉下积累的内源性HIF1α。上排是在正常条件下的情况（+1 µM MG132）。下排是在邻菲罗啉刺激下的情况（+2 µM）。

点击查看Janelia Fluor^{^®} HaloTag^{^®}配基详情介绍

如需订购产品可点击此处联系您所在地经销商

总结

荧光配基和染料领域已经见证了显著的进步，这是由生物研究中对更精确、稳定和多用途成像工具的需求驱动的。这也确实使得为您的实验寻找合适的染料变得更加复杂。我们希望这篇内容能帮助您找到照亮科学之路的完美方法。

资料下载（点击下方图片下载相应的技术资料）

HaloTag^{^®}蛋白标签技术手册

Janelia Fluor^{^®} HaloTag^{^®}配基介绍

参考文献

上下滑动阅览

1. Allikalt, A., Purkayastha, N., Flad, K., Schmidt, M. F., Tabor, A., Gmeiner, P., Hübner, H., & Weikert, D. (2020). Fluorescent ligands for dopamine D2/D3 receptors. Scientific Reports, 10(1).

https://doi.org/10.1038/s41598-020-78827-9

2. Breen, C. J., Raverdeau, M., & Voorheis, H. P. (2016). Development of a quantitative fluorescence-based ligand-binding assay. Scientific Reports, 6.

https://doi.org/10.1038/srep25769

3. Grimm, J. B., & Lavis, L. D. (2022). Caveat fluorophore: an insiders’ guide to small-molecule fluorescent labels. In Nature Methods (Vol. 19, Issue 2, pp. 149–158). Nature Research.

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01338-6

4. Grimm, J. B., Muthusamy, A. K., Liang, Y., Brown, T. A., Lemon, W. C., Patel, R., Lu, R., Macklin, J. J., Keller, P. J., Ji, N., & Lavis, L. D. (2017). A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature Methods, 14(10), 987–994.

https://doi.org/10.1038/nmeth.4403

5. Hayashi-Takanaka, Y., Stasevich, T. J., Kurumizaka, H., Nozaki, N., & Kimura, H. (2014). Evaluation of chemical fluorescent dyes as a protein conjugation partner for live cell imaging. PLoS ONE, 9(9).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106271

6. Heinrichs, A. (2009). Stains and fluorescent dyes. Nature Cell Biology, 11(S1), S7–S7.

https://doi.org/10.1038/ncb1939
7. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., & Hajnóczky, G. (2017). Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports, 3(4–6), 64–72.

https://doi.org/10.1007/s41048-017-0037-8

8. Lucidi, M., Capecchi, G., Visaggio, D., Gasperi, T., Parisi, M., Cincotti, G., Rampioni, G., Visca, P., & Kolmakov, K. (2023). Expanding the microbiologist toolbox via new far-red-emitting dyes suitable for bacterial imaging. Microbiology Spectrum.

https://doi.org/10.1128/spectrum.03690-23

9. Mahmoudian, J., Hadavi, R., Jeddi-Tehrani, M., Mahmoudi, A. R., Bayat, A. A., Shaban, E., Vafakhah, M., Darzi, M., Tarahomi, M., & Ghods, R. (n.d.). Comparison of the Photobleaching and Photostability Traits of Alexa Fluor 568-and Fluorescein Isothiocyanate-conjugated Antibody.

10. Salari, M., Bitounis, D., Bhattacharya, K., Pyrgiotakis, G., Zhang, Z., Purington, E., Gramlich, W., Grondin, Y., Rogers, R., Bousfield, D., & Demokritou, P. (2019). Development & characterization of fluorescently tagged nanocellulose for nanotoxicological studies. Environmental Science: Nano, 6(5), 1516–1526.

https://doi.org/10.1039/c8en01381k

11. Sridharan, R., Zuber, J., Connelly, S. M., Mathew, E., & Dumont, M. E. (2014). Fluorescent approaches for understanding interactions of ligands with G protein coupled receptors. In Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes (Vol. 1838, Issue 1 PARTA, pp. 15–33).

https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2013.09.005

竞答有

奖

前10名

可获得斜挎小方包1个

●

问题

文中提到的JF549配基(Cat#HT1020)属于Promega提供的Janelia Fluor^{^®} HaloTag^{^®} Ligands系列，应用方向包括：（多选）

1.超分辨率和高分辨率成像

2. 标准共聚焦成像

3. 流式细胞分选（FACS）

4. 荧光成像仪下的凝胶内检测

请在本次微信帖下方留言给出您的答案（回复序号即可，比如：123）。回答正确的前10位小伙伴可获得时尚斜挎小方包一个！

活动时间：截止到2024年8月2日17：00。

活动仅限Promega终端用户参加。该活动最终解释权归普洛麦格（北京）生物技术公司所有。

GIFT///

ABOUT PROMEGA

关于Promega公司

Promega Corporation是一家为生命科学行业提供高质量解决方案和技术支持的全球领先生物技术企业。在其44年的历史中，Promega已建立了包含有4000多种支持细胞和分子生物学的目录产品和定制产品的组合。如今，Promega开发的萤光素酶(即荧光素酶)等技术推动了活细胞分析、药物发现、分子诊断和人体识别等领域的创新，并且由实验室科学家和技术人员用于学术和政府研究、法医学、制药、临床诊断以及农业和环境检测。Promega总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16个国家设有分公司，拥有50多家全球经销商。如需获取更多信息，请访问www.promega.com。

关注Promega