沉默AAV载体的免疫原性
Promega提供的NanoLuc®萤光素酶和Nano-Glo® Fluorofurimazine In Vivo Substrate（体内成像底物）可用于体内生物发光成像，以研究AAV突变体在小鼠体内的分布和转导效率，进一步探究AAV载体的免疫原性。
关键词：基因治疗、免疫沉默、AAV载体、体内成像、AAV分布、AAV转导效率。
01
重组腺相关病毒（AAV）载体
重组腺相关病毒（AAV）载体是体内基因治疗的一种具有吸引力的递送策略，但也面临着一个巨大的挑战：如何避免被一直警惕的免疫系统检测到（1,2）。为了补偿对这些病毒颗粒的免疫反应，已经采取了包括免疫抑制药物和改造AAV载体使其提高效力从而最小化有效剂量等措施。然而，这些方法也带来了各自的挑战，并不能直接解决AAV载体诱导免疫反应的倾向。
最近的一项研究引入了一种新方法来减少AAV载体固有的免疫原性（2）。研究人员有策略性地置换了AAV衣壳蛋白中的氨基酸，以消除T细胞识别的特定序列（能够引发最强烈的免疫反应）。结果，他们显著降低了AAV载体的T细胞介导的免疫原性和毒性，而不影响其性能。
02
合理的免疫沉默
研究人员致力于AAV9血清型的研究，这种血清型在众多已知的AAV血清型中以其有效感染各种组织类型的能力以及相对较好的免疫特性而闻名，除此之外还有其他优点（1,3）。对AAV9血清型的衣壳蛋白进行修饰以期合理抑制其免疫原性，需要以下三个关键步骤：
PART-1
在 AAV9 衣壳蛋白中识别哪些氨基酸序列是免疫优势表位。
免疫优势表位是抗原中被免疫系统识别并相对于其他抗原引发最强免疫反应的特定区域。研究人员首先准备了242个单独的肽段，覆盖了AAV9衣壳蛋白VP1的整个氨基酸序列。然后，他们测量了这些肽段在人外周血单个核（PBMC）细胞中引发的免疫反应，这些细胞是通过与AAV9衣壳接触而扩增的。最强烈的免疫反应是由103-105号肽段引发的，它们对应VP1的氨基酸307-327。这个表位被CD4+ T细胞识别，并且与HLA-DP（一种细胞表面受体，向CD4+ T细胞呈递抗原）发生多态性结合。
PART-2
检查免疫优势表位中的哪些氨基酸在AAV血清型中是保守的。
为了潜在地识别免疫优势表位中可能因为它们在AAV血清型之间不保守而适合突变的氨基酸，研究者转向了序列比对。对12种AAV血清型的序列比对显示，AAV9免疫优势表位中的氨基酸307-325是保守的。然而，血清型AAV5含有五个非保守氨基酸。研究人员发现，相应的AAV5肽段并没有刺激经AAV5衣壳扩增的PBMCs产生免疫反应。利用这些信息，他们计划根据AAV5中的非保守氨基酸战略性地修改AAV9免疫优势表位的序列，假设这可能降低AAV9载体的免疫原性，同时保持其功能。
PART-3
预测对AAV9氨基酸序列进行哪些修改会导致与更少的HLA分子结合。
研究人员使用免疫表位数据库（Immune Epitope Database）结合算法来预测修改后的AAV9多肽序列与HLA等位基因的结合亲和力。这些修改是基于之前在AAV5中确定的非保守氨基酸。根据这些发现，他们准备了两种显示降低结合亲和力的多肽变体。其中一种用对应于AAV5的氨基酸替换了两个AAV9残基（F315V和L317I）；另一种替换了五个氨基酸（K311R、R312S、N314R、F315V和L317I）。
在AAV9表位变体中引入的突变不在AAV9衣壳蛋白的表面，并且不包括病毒颗粒功能所需的氨基酸。因此，研究人员预测，除了减少免疫反应外，具有这些修改序列的AAV9衣壳蛋白与原始载体具有相似的效力和功能。
03
对“免疫沉默”AAV载体进行测试
为了量化改良后的AAV9衣壳蛋白的行为，研究人员将NanoLuc®报告基因插入AAV载体中。在制备含有改良的AAV9衣壳蛋白的病毒颗粒时，他们观察到与使用母体AAV9衣壳蛋白制备的病毒颗粒相比，病毒颗粒的质量或性能没有任何差异。此外，这些改良并没有影响载体将NanoLuc®报告基因递送至细胞的能力，也没有影响抗AAV抗体中和载体的能力。
在这些体外实验之后，研究人员将携带NanoLuc®报告基因的突变AAV9载体注射到小鼠体内。他们通过连续几周注射NanoLuc®萤光素酶活体成像底物NanoGlo® Fluorofurimazine，并通过活体生物发光成像检测方法来测定萤光素酶的表达。注射了突变AAV9载体的小鼠的萤光素酶表达水平与注射了亲本AAV9载体的小鼠相似。更重要的是，萤光素酶表达可在注射后的29天内保持稳定。
Nano-Glo® Fluorofurimazine In Vivo Substrate（FFz）专为体内检测NanoLuc®萤光素酶而设计。可在其产品页面上找到其他使用FFz进行活体成像的研究案例。
AAV载体对特定的组织和器官具有选择性，这种特性称为嗜性。研究人员发现，亲本AAV9载体在小鼠的肝脏、心脏和胸腺中高表达NanoLuc®报告基因。而AAV5载体在这些器官中的表达受限，仅限于小鼠的肝脏和肺部。相比之下，突变的AAV9载体显示出与亲本AAV9载体相似的分布和表达水平。
最终，研究人员发现，不同于之前用野生型AAV9扩增的PBMCs，突变型AAV9载体扩增的PBMC用突变型AAV9肽再次刺激能引发较低水平的免疫激活。
综上所述，这些结果表明研究人员能够有计划地修改AAV载体，以避免不良的免疫反应，同时保持载体功能。他们相信他们的方法可以用于“免疫沉默”其他AAV载体，并改善体内基因疗法。
如需了解更多支持AAV研究的工具，请访问我们的AAV解决方案产品组合及其应用页面。
如需订购上述文章中使用的活体成像底物，请联系您所在地经销商。
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萤光素酶 |
活体成像底物 |
目录号 |
规格 |
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NanoLuc® 萤光素酶 |
Nano-Glo® Fluorofurimazine In Vivo Substrate (FFz) |
N4100 N4110 |
1 each 5 each |
参考文献
1. Mingozzi, F. and High, K.A. (2011) Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress and challenges. Nat. Rev. Genet. 12,341.
2. Bing, S.J. et al. (2023) Rational immunosilencing of a promiscuous T-cell epitope in the capsid of an adeno-associated virus. Nat. Biomed. Eng. 8, 193.
doi: 10.1038/s41551-023-01129-8
3. DiMattia, M.A., et al. (2012) Structural Insight into th Unique Properties of Adeno-Associated Virus Serotype 9. Journal of Virology. 86, 6947.
05
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