一种用于准确定量病毒基因组和确定脂质纳米颗粒封装效率的新技术
Promega最新发布的TruTiter™ Reagent System无需DNase处理步骤，即可通过评估AAV衣壳完整性，实现基于dPCR或qPCR的病毒基因组的一致定量。
关键词：腺相关病毒（AAV）、病毒基因组定量、病毒滴度测定、qPCR、dPCR、ddPCR。
快速了解本篇文章介绍重点。
内容概要
Promega最新开发的AAV病毒基因组定量分析新工具：
• TruTiter™试剂相比DNase，是确定AAV基因组滴度的一致性测定的可靠替代品。
• TruTiter™试剂还可以通过测量被保护的遗传载荷来确定LNP封装效率。
基本介绍
腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）载体作为基因治疗的递送系统展现了巨大的潜力。然而，建立可靠的定量分析、感染活性检测及剂量确定方法仍存在挑战。脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNP）作为递送系统同样获得成功应用，COVID-19疫苗的研发成果已充分证明其有效性。对于LNP的表征方法，确定封装效率仍是亟待解决的技术难点。
TruTiter™试剂是一种小分子，它被排除在具有完整蛋白质衣壳的病毒、活细胞或具有完整膜的脂质纳米颗粒（LNPs）等包封或区室化的大分子结构之外。然而，该分子可以共价结合暴露的核酸并阻止其随后通过PCR扩增。这一特性使得可以选择性地扩增完全包封的核酸，从而准确测量完整的AAV和LNP基因组滴度。
上图. TruTiter™试剂对受损AAV的PCR扩增抑制作用。
工作流程
上图. 使用TruTiter™试剂定量AAV基因组滴度的工作流程。绝对定量可通过数字PCR进行。
性能分析
01
使用TruTiter™ 试剂显著降低变异性
AAV2、AAV8和AAV9在65°C下热处理5分钟，部分诱导病毒颗粒的结构损伤。使用DNase或TruTiter™试剂处理，通过ddPCR进行基因组滴度测定。
结果：使用TruTiter™试剂测得的基因组滴度值的标准差更低（更精确）。
02
使用TruTiter™试剂测得与其他ddPCR方法相似的结果
TruTiter™试剂是AAV基因组滴度测定中DNase的替代品！
AAV血清型采用不同方法进行预处理，并通过qPCR或ddPCR ITR检测法进行分析。
结果：使用TruTiter ddPCR测得的基因组滴度值与其他ddPCR方法相似。
03
使用TruTiter™试剂测定LNP封装效率
▪ TruTiter™ 试剂被排除在LNP颗粒之外，从而保护内部的核酸。这一特性用于确定封装效率，该参数对于以下方面具有重要意义：
• 选择合适的脂质类型
• 理解储存条件
LNP中使用的脂质通常是逆转录酶和DNA聚合酶的抑制剂。这使得核酸纯化成为分析LNP封装效率的前提条件。
下图. 我们使用转染试剂作为形成LNP的替代物。体外转录的RNA与能够或不能形成LNP复合物的转染试剂一起孵育。每个样本在有和没有TruTiter™试剂处理的情况下进行中和及核酸提取，然后通过RT-qPCR分析目标基因的扩增情况。封装效率使用上述公式确定。
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